Terapia regenerativa da microbiota intestinal em filhotes de cães: relato de caso

ARTIGO ORIGINAL

Terapia regenerativa da microbiota intestinal em filhotes de cães: relato de caso

Aldo Rodrigues Barbugli Filho¹ ; Creusa Sayuri Tahara Amaral²

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1. Introdução

 A microbiota intestinal de cães, gatos e humanos é composta por diversos microrganismos, sendo as bactérias a população predominante no intestino[1]. Denomina-se “microbioma” os conjuntos de microrganismos que interagem com o ambiente intestinal. Esses conjuntos abrangem vírus, protozoários e parasitas, além das bactérias. Os estudos em humanos e animais têm demonstrado crescente interesse em compreender a influência do microbioma intestinal na saúde e nas doenças dos mamíferos [2]. Um microbioma instável, com predominância de espécies de bactérias oportunistas como Escheria coli patógenas e Streptococus, pode levar a distúrbios gastrointestinais específicos e de difícil remissão em cães, gatos, como a doença inflamatória intestinal, bem como a síndrome do intestino irritável em humanos [3].

O uso de antibióticos, em muitos casos, pode potencializar o desequilíbrio da microbiota, favorecendo o crescimento de bactérias indesejáveis [3]. A diarreia, caracterizada pela umidade das fezes em excesso, acima de 85%, e pela consistência líquida, de acordo com a escala de Bristol [4], está associada a desequilíbrios na microbiota intestinal, o que pode levar a complicações graves, especialmente em animais jovens, tanto em cães quanto em humanos [5].

A disbiose intestinal pode resultar em distúrbios eletrolíticos, desidratação e aumento do muco intestinal, que associado à ocorrência de SIBIO (Super Infecção por Bactérias Intestinais Oportunistas), definido clinicamente como aumento descontrolado de toda microbiota, pode causar danos ao organismo, tanto em cães quanto em humanos. Sabe-se que valores acima de log 1012 microrganismos por grama já se caracteriza disbiose, segundo o painel de diagnóstico para cães e gatos [3].

O aumento e alteração da permeabilidade celular do intestino, consequência de inflamações localizadas em cólon, ílio e duodeno podem alterar de forma irreversível as vilosidades intestinais levando o paciente a um permanente estado de disfunção digestiva e absorção do alimentos [6] ocasionando perda de peso e maior suscetibilidade a outras infecções. O diagnóstico preciso e precoce da disbiose é fundamental para entender e tratar doenças, não apenas aquelas que afetam o intestino, mas também outras doenças que podem ter origem no desequilíbrio da microbiota. Alterações endócrinas, metabólicas, renais e até neurológicas podem ter estreita relação com o status microbiológico do intestino, o que pode estar associado a uma instabilidade do microbioma e a quadros de disbiose, conforme evidenciado por estudos recentes [7].

Atualmente, o diagnóstico de disbiose pode ser realizado por exame de fezes, que utiliza o sequenciamento bacteriano do método do DNA ribossomal 16S para identificar microrganismos [3] e também por biomarcadores como a calprotectina S100A8/A9 e a bromotirosina 3-Br-y, que também podem ser usados como indicativos para disbiose por ​​ mensurarem a atividade eosinofílica na mucosa intestinal [8].

O microbioma na maioria dos mamíferos é individualizado como uma impressão digital única. Sua composição é formada a partir do nascimento e é influenciada por fatores ambientais, nutricionais, e epigenéticos, que interagem na construção e manutenção de um microbioma saudável e estável [9].

A “humanização” dos animais de estimação, associada a uma piora do manejo alimentar e aos hábitos de higiene excessivos, somada ao decréscimo de exposição a ambientes naturais, tem levado a um aumento nos quadros de problemas intestinais em cães [10]. O transplante de microbiota fecal (TMF) é uma estratégia eficaz na restauração da microbiota intestinal, sendo amplamente utilizado com sucesso para o tratamento de diarreias, enteropatias e atopias dermatológicas crônicas, em humanos e animais [11].

O Transplante de Microbiota Fecal (TMF) é um procedimento que transfere a microbiota intestinal saudável de um indivíduo doador para o intestino de um receptor para restaurar o equilíbrio da microbiota intestinal e tratar condições médicas associadas a desequilíbrios em sua composição [12]. O TMF é um procedimento de baixo risco e pode ser realizado por meio de vários métodos: capsulas orais, colonoscopia e enemas retais, sendo este o mais utilizado na medicina veterinária de cães e gatos [3].

Consideráveis avanços na área de conhecimento sobre a microbiota intestinal têm sido aprimorados por estudos recentes, incluindo estudos de metabolômica, que auxiliam na compreensão das interações entre a microbiota e o hospedeiro, propiciando o desenvolvimento de novos diagnósticos e terapias para doenças intestinais e outras doenças crônicas [13].

Crescentes pesquisas e terapias baseadas em evidências na medicina veterinária apontam diversas soluções capazes de mitigar as inflamações crônicas de baixo grau. Alguns exemplos incluem: dietas naturais; rações terapêuticas; uso de nutracêuticos como a suplementação com Ômega 3; fitoterápicos como resveratrol e associações simbióticas de betaglucanas como FOS (Frutooligossacarídeos), MOS (Mananoligossacarídeos) e GOS (Galactooligossacarídeos), que são considerados ​​ anti-inflamatórios naturais. Na verdade é o efeito dessas betaglucanas nas bactérias, que modulam as inflamações e estão relacionadas com a nutrição das bactérias desejáveis [14].

No entanto, existem algumas limitações nessas terapias: os custos elevados e as dosagens terapêuticas que ainda precisam ser melhor definidas [15]. Apesar dessas ressalvas, esses tratamentos representam ferramentas terapêuticas promissoras para o manejo de inflamações crônicas em animais de estimação. À medida que as pesquisas avançam, espera-se que esses métodos se tornem mais acessíveis e eficazes.

O objetivo deste artigo é apresentar um relato de caso, que confirma as vantagens e benefícios do transplante fecal como opção terapêutica e mostrou-se eficaz para o tratamento de enteropatias não responsivas a antibióticos, quando já existe alterações importantes na permeabilidade das mucosas intestinais com intensa disbiose.

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2. Relato do caso

No dia 18 de fevereiro de 2024 uma cadela da raça Rottweiler, de 2 anos de idade, 45 quilos, deu a luz a 14 filhotes, ao completar 59 dias de gestação, segundo seus tutores. Essa fêmea foi acasalada por monta natural com macho da mesma raça. Os tutores desconheciam a relevância dos cuidados necessários no manejo do pré-natal e não buscaram orientação ou ajuda sobre os cuidados com a gravidez da cadela. Assim a ​​ fêmea gestante não recebeu suplementação durante a gestação.

O parto não foi acompanhado por veterinário. O intervalo de tempo entre o primeiro filhote e o último foi de aproximadamente 20 horas, segundo relato dos próprios tutores, evidenciando o esforço que a cadela foi submetida para o parto. Dos 14 filhotes, 8 nasceram mortos porém sem apresentar quaisquer anomalias, como má formação e anasarca.

Sabe-se que a mortalidade fetal e neonatal em cães pode ser causada por fatores infecciosos e não-infecciosos, sendo um problema frequente, principalmente quando a gestação e o parto transcorrem sem acompanhamento e orientação técnica[16]. Erros de manejo, desnutrição e a imaturidade fetal ao final da gestação são fatores predisponentes a mortalidade dos neonatos [17]. As causas não-infecciosas incluem hipóxia, prematuridade, hipotermia, hipoglicemia, doenças genéticas, desnutrição, trauma, intoxicações e partos distocitos [18].

Entre as causas infecciosas, as bacterianas destacam-se como as mais importantes, além de viroses e parasitoses. Para identificar a causa da morte fetal e neonatal, seria necessário realizar necropsia, exame histopatológico e pesquisa de agentes infecciosos nos tecidos, o que não pode ser realizado no caso em relato. Desde a fertilização até o desmame, os neonatos são vulneráveis a fatores que podem causar sua morte, malformações ou o nascimento de filhotes fracos, que aumentam os riscos de morte nos primeiros dias de vida. Assim, o risco de mortalidade fetal depende do momento do fato e do agente etiológico envolvido [19].

No caso em relato, após o parto, a cadela apresentou manifestações de dores fortes, hiporexia, febre e presença de importante corrimento fétido, o que levou a suspeita de uma infecção devido às complicações do parto, que culminaram com a morte da cadela. Analisando o fato, acredita-se que provavelmente o óbito da cadela estivesse associado à retenção de placenta, infecção pós parto e até mesmo algum feto natimorto não expelido. Essas hipóteses foram relatadas pelo veterinário que atendeu os filhotes com dez dias de vida.

Dentre os seis filhotes vivos, um foi a óbito, alguns dias após seu nascimento, devido a um acidente doméstico. Os cinco filhotes restantes foram alimentados com leite artificial, prescrito pelo veterinário consultado. Foi utilizado o produto Pet milk por apenas 10 dias e com 20 dias de idade receberam alimentação, preparada com o produto ​​ Premier Papy.

Com 35 dias os filhotes já receberam ração seca para filhotes da marca Premier, até os 60 dias de vida. Sob este tratamento mais três filhotes foram a óbito. Neste momento os dois filhotes restantes foram encaminhados para um novo atendimento veterinário e receberam novas orientações sobre alimentação e sobre novas terapias ​​ para o tratamento da intensa diarréia.

Os dois filhotes sobreviventes apresentavam forte diarreia intermitente, muito liquida, fétida, hematoquezia, com grau 3 de desidratação. No entanto não estavam prostados e apresentavam normofagia. Os filhotes haviam sido submetidos a uma sucessão de erros de manejo, mas o maior destaque deve ser dado à condução da alimentação.

O estado de saúde foi agravado, após o veterinário anterior prescrever a administração de antibióticos e probióticos para os filhotes, com o objetivo de sanar a diarréia, que não responderam bem aos tratamentos, agravando drasticamente o quadro clínico dos filhotes. Os dois filhotes apresentaram resultados negativos para parvovirose, giardiase, isospora e demais parasitoses.

Embora a colonização microbiana seja tradicionalmente atribuída ao nascimento, alguns estudos indicam que o microbioma intestinal de filhotes recém-nascidos, o feto a termo já pode abrigar bactérias. O desenvolvimento da microbiota começa ainda na vida fetal e é influenciado pelo tipo de parto, colostro, leite, ambiente e dieta. A microbiota materna e sua dieta também impactam na microbiota intestinal dos filhotes, sendo fatores críticos para sua sobrevivência [19].

Verifica-se assim a hipótese de que esses filhotes, que sobreviveram aos 60 dias tinham uma condição desfavorável na formação do microbioma intestinal decorrente dos antecedentes de gestação e das condições do parto. Situação esta, condizente com a manifestação clínica de diarreia intermitente, desidratação e disfunção digestiva importante, verificada na anamnese dos filhotes, que ainda corriam alto risco de não sobreviverem.

Foi então, que após analisar toda conjuntura e diante de um possível quadro de importante disbiose, associada a baixa imunidade, com elevado risco de prejuízo irreparável do microbioma intestinal, que foi proposta a suspensão imediata do tratamento vigente com antibióticos e a realização do transplante fecal como opção terapêutica para a regeneração da microbiota dos filhotes.

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3. Resultados e discussões

Antes da realização do transplante fecal, os dois filhotes pesavam cerca de 4 quilos cada um, apresentavam desidratação de grau 3. A tabela 1 apresenta os resultados do hemograma antes do transplante e após o transplante, de modo que é possível comprovar a melhora dos valores de referência para o hemograma, como por exemplo a hemoglobina que para o filhote macho antes do TMF era de 11,0 g/dL e passou para 15,0 g/dL, os leucócitos eram 29.400 células/mm3 passando para 12.200 células/mm3.  ​​​​ 

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Tabela 1 – Exame de sangue antes e depois do TMF

Os enemas transplantados nos pacientes foram previamente preparados em laboratório, com detalhada análise clínica dos doadores, além de um minucioso estudo das características da microbiotas dos doadores (sequenciamento genético), descritos na tabela 2.

Tabela 2 – Os doadores de enema Lorrine, Bhor, Odin e Thor passaram por rigorosos testes clínicos e análises de microbiota, descrevendo as principais bactérias presentes em suas fezes. A partir do sequenciamento 16S rRNA.

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As fezes dos filhotes foram coletadas antes e após o TMF e a descrição do microbioma são apresentados na tabela 3. A partir da análise da tabela 3 é possivel verificar a transformação do microbioma dos filhotes, 30 dias após o transplante. O transplante fecal foi realizado no hospital veterinário VFP – Unidade Araraquara, com ajuda da equipe cirurgica do hospital. Os animais ficaram internados por 2 horas após o procedimento e foram alimentados somente 4 horas após a realização do transplante, para evitar refluxo do enema infundido. A Figura 1 ilustra a técnica do transplante fecal e na Figura 2 a foto original do transplante sendo realizado com o paciente.

Figura 1 - Detalhes da manipulação da infusão do enema fecal. A sonda deve ser inserida na região do cólon descendente. Referência anatômica para medir as cristas ilíacas porque, cranial a elas, certamente não estará na ampola retal. O enema deve ser ejetado neste ponto exato, pois ele percorrerá por todo o cólon, uma porção do intestino grosso, onde reside 85% do microbioma.

Figura 2 - Foto original do procedimento de transplante fecal realizado no paciente, no hospital veterinário VFP – Unidade Araraquara, com ajuda da equipe cirúrgica do hospital.

Tabela 3 – Amostras de DNA foram submetidas à amplificação de todo o gene 16S rRNA usando os primers 27F e 1492R (fragmento de ~ 1,6 kb). Os resultados da análise do sequenciamento de fezes dos filhotes permite a identificação e classificação de bactérias com base em suas sequências de DNA antes do TMF e após.

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Figura 3 - Análise da microbiota dos filhotes antes do FMT e 30 dias depois. Os dados no lado esquerdo do gráfico exibem a microbiota dos filhotes antes do transplante, indicando que eles tinham predominantemente bactérias não desejáveis em sua microbiota. No lado direito, mostra que a microbiota do filhote macho agora consiste em 70% de bactérias desejáveis, enquanto a da filhote fêmea consiste em 70,2% de bactérias desejáveis. Para referência, o doador de enema tem 95,63% de bactérias desejáveis.

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A Figura 3 ilustra os dados da tabela 2 e 3, que descrevem as bactérias presentes nas fezes dos doadores e dos filhotes antes e depois do transplante. Agrupou-se a porcentagem de bactérias presentes nas fezes em duas categorias, sendo que uma como as bactérias desejáveis e em outra aquelas indesejáveis. No caso dos filhotes (dados da tabela 3), verificou-se que a população de bacterias desejaveis migrou de 0,00% para 70% 30 dias pós o transplante no filhote macho e para a fêmea o valor passou de 0,00% para 70,2%. A população de bactérias indesejáveis chegou a 28% após transplante e o valor anterior era de 100% no filhote macho. É importante ressaltar que os valores de bactérias desejáveis dos doadores é superior a 90%, ou seja, uma pequena parcela ​​ identificada de bactérias são indesejáveis nas fezes dos doadores, garantindo a segurança no procedimento. ​​ 

A literatura científica que trata sobre o sequenciamento do bioma intestinal de animais saudáveis, que não apresentam disbiose intestinal, é crescente e reveladora. Animais, considerados hígidos em relação às gastroenteropatias, como doenças intestinais crônicas, linfangiectasias, pancreatites, hemoparasitas, disfunções renais e endócrinas, apresentam predominância dos filos e gêneros bacterianos: Faecalibacterium, Prevotellaspp., C. Hiranonis, Lactobacillus, Bifidobacterium, Blaudia e Firmicutes [8].

Biomas intestinais com baixa quantidade de C. hiranonis estão associados a uma conversão reduzida de ácidos biliares primários em secundários. Essa conversão é crítica para a homeostase fisiologica intestinal, pois existe uma forte correlação com quadros de disbiose intestinal e a qualidade das fezes, diminuindo a digestibilidade, e comprometendo a absorção de nutrientes. Além disso, é comum observar um aumento nas inflamações intestinais em casos de enteropatias inflamatórias crônicas e colite idiopática, bem como após a administração de antibióticos [9].

Para avaliar os efeitos do TMF sobre os sintomas gastrointestinais dos filhotes, foi elaborado um indicador de saúde, um score, que foi baseado em um formulário preenchido pelos tutores, por um período de 90 dias, em que os tutores descreveram características como: o estado das fezes, ou seja, fezes com forma e sem muco, que recebeu uma pontuação alta (10), dada a situação ideal esperada; fezes ressecadas e mais de 2 dias sem defecar (03); fezes com muco (02); fezes sem formato (-1); diarreia ( -3); diarreia com sangue (-5). A partir dessas notas foram calculados os scores pela soma simples de 5 dias. Assim, o valor 50 representa um estado ótimo para as características das fezes, que estão associadas ao estado da microbiota intestinal. Esses dados estão ilustrados na Figura 4. Verifica-se que antes do transplante, os scores calculados a partir das informações fornecidadas pelos tutores foi 10 e logo após o primeiro transplante, houve uma significativa melhora desse score para ambos filhotes e se mantiveram em nível bom ao longo de todo o período de monitoramento.

Figura 4 - Os filhotes foram monitorados por 90 dias, e o gráfico ilustra as pontuações calculadas para avaliar o nível de saúde entérica dos filhotes. Antes do transplante, a pontuação fornecida pelos tutores foi baixa, atingindo o score 10, devido ao quadro de disbiose dos filhotes. Após o primeiro transplante, a pontuação melhorou significativamente para os dois filhotes e permaneceu em um nível satisfatório durante todo o período de monitoramento de três meses. Cada unidade no eixo X representa cinco dias de análise.

Assim, os animais apresentaram melhora na constituição das fezes em 48 horas pós transplante, migrando de uma manifestação diarreica, fezes líquidas, para uma situação de fezes com formato e pouco muco. Segundo relato dos tutores os animais, desde o nascimento, não tinham apresentado fezes com formato. A partir dos relatos, os filhotes seguiram nos 30 dias pós transplante com as fezes com normofagia, normodipsia, normouria, e normoquezia. Os filhotes ganharam peso, a fêmea de 4,0 quilos passou a 6,0 quilos após 30 dias, 8 quilos após 60 dias e 10 quilos após 90 dias. O filhote macho passou de 4 quilos para 7,0 quilos, em 30 dias, 9,0 quilos após 60 dias e 12 quilos após 90 dias. Este acompanhamento longitudinal fortalece a confiabilidade do tratamento, sua eficiência e a permanência do seu efeito, além de ausência de efeito colateral relatado no caso avaliado no período.

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4. Conclusões finais

O transplante fecal se mostrou uma intervenção eficaz na melhoria clínica dos animais tratados com disbiose intestinal. Este relato de caso corrobou com dados de pesquisas que apontam o potencial que essa terapia tem para promover mudanças significativas no microbioma intestinal, restaurando o equilíbrio da microbiota e, consequentemente, melhorando de modo consolidado os sintomas clínicos dos pacientes tratados.

Por meio das análises de sequenciamento do microbioma intestinal foi possível avaliar as alterações na composição da microbiota antes e após o transplante fecal. Essas mudanças estão diretamente associadas à melhora clínica observada nos animais tratados, evidenciando a eficácia do transplante fecal como uma intervenção terapêutica eficaz.

Além de ser eficaz no tratamento da disbiose intestinal dos filhotes tratados, o transplante fecal foi capaz de revitalizar a condição gastrointestinal ameaçada de se tornar disfuncional, sem a presença de qualquer tipo de reação relatada pelos tutores, durante o período de monitoramento. Quando o equilíbrio da microbiota é restaurado, a função gastrointestinal é otimizada, permitindo uma melhor digestão e absorção dos nutrientes essenciais para o desenvolvimento saudável dos filhotes, o que pode ser evidenciado com o ganho de peso dos mesmos.

O transplante fecal se apresentou como uma alternativa terapêutica promissora no tratamento dos distúrbios gastrointestinais dos pacientes, sem oferecer riscos e efeitos colaterias, como ocorre com outros tratamentos. Ao restaurar a composição saudável da microbiota intestinal, essa intervenção não apenas melhorou os sintomas clínicos, mas também previniu a progressão de doenças gastrointestinais, garantindo o desenvolvimento adequado dos filhotes no período observado. Mais estudos são necessários para aprimorar e padronizar os protocolos de transplante fecal, maximizando seus benefícios e aplicabilidade na medicina veterinária.

5. Declaração de direitos

 O(s)/A(s) autor(s)/autora(s) declara(m) ser detentores dos direitos autorais da presente obra, que o artigo não foi publicado anteriormente e que não está sendo considerado por outra(o) Revista/Jornal. Declara(m) que as imagens e textos publicados são de responsabilidade do(s) autor(s), e não possuem direitos autorais reservados à terceiros. Textos e/ou imagens de terceiros são devidamente citados ou devidamente autorizados com concessão de direitos para publicação quando necessário. Declara(m) respeitar os direitos de terceiros e de Instituições públicas e privadas. Declara(m) não cometer plágio ou auto plágio e não ter considerado/gerado conteúdos falsos e que a obra é original e de responsabilidade dos autores.

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