Abundância de RNA do sistema calpaínas-calpastatina, genes relacionados à qualidade da carne de ruminantes: uma revisão

ARTIGO ORIGINAL

Abundância de RNA do sistema calpaínas-calpastatina, genes relacionados à qualidade da carne de ruminantes: uma revisão

Isabella Guartieri da Silva¹; Lorraine Pissinin Dutra²; Ines Cristina Giometti³; Calie Castilho⁴; Gabriella Capitane Sena⁵; Letícia Jalloul Guimarães⁶; Natália Carolina Vieira⁷; Quézia Hadassa Machado Leite⁸; Maria Fernanda Gibim⁹; Isadora de Souza e Silva¹⁰; Fabiola Cristine De Almeida Rêgo¹¹; ​​ Marilice Zundt¹²

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Calpains-calpastatin system RNA abundance, genes related to ruminant meat quality: a review

Abstract

The consumer market demands for lamb meat have increased and to meet these demands, production must be optimized in a complex way, and the qualitative attributes have many variables, influenced mainly by genetics, and other factors such as nutrition and pre- and post-slaughter processing. The tenderness is the main attribute considered by consumers and during the meat tenderizing process, there is the action of specific genes that determine the final result. These genes activate the calpain-calpastatin enzymatic system, which is formed by two calpains: μ-calpain and m-calpain, which play an important role in the main intracellular processes. With emphasis on cytoskeleton restructuring, cell cycle regulation, apoptosis, and muscle tissue formation. In contrast, the CAST gene inhibits calpains and also influences the production, tenderness and quality of the meat. Therefore, RNA analysis is a necessary step in the preparation of methods such as RT-qPCR. Studies have shown for years that the calpain-calpastatin complex acts directly in muscle proteolysis, in the transformation of muscle into meat, becoming responsible for its quality, however, more investigations are suggested about the level of RNA abundance for CAPN1, CAPN2 and CAST genes, especially in ovines.

Keywords: μ-Calpaína. Calpastatina. m-Calpaína. Ovis aries. RT-qPCR.

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1. Introdução 

O desenvolvimento de estratégias para agregar valor e diferenciar a carne ovina, com o objetivo de atender às crescentes demandas dos consumidores, representa uma importante oportunidade para o sistema agroindustrial ovino [1]. A qualidade da carne é um conceito multifatorial, influenciado por diversas variáveis, incluindo genética, nutrição, sanidade e manejo pré e pós-abate. Entre essas variáveis, a maciez destaca-se como uma das características mais apreciadas pelo consumidor final [2].

Assim, a avaliação da qualidade da carne por meio de testes químicos e físicos tem se tornado cada vez mais comum nas pesquisas, constituindo uma ferramenta essencial para orientar a escolha da dieta fornecida aos animais. A dieta influencia diretamente a composição da carne, e animais que recebem maiores proporções de concentrados tendem a apresentar carne com maior teor de gordura, o que, por sua vez, eleva a suculência e a percepção de maciez [3] [4].

Boas práticas de manejo são capazes de melhorar tanto o desempenho quanto o bem-estar animal. Contudo, para otimizar esses resultados, é fundamental compreender a estrutura e função dos genes associados à maciez da carne, bem como sua interação com fatores não genéticos dos sistemas de produção, como nutrição e ambiente [5]. Esse conhecimento pode ser decisivo para alcançar resultados mais precisos e atender à crescente demanda global por carne de qualidade [6]. Assim, o sistema proteolítico calpaína-calpastatina, intimamente ligado à maciez da carne, tem sido investigado em nível de miRna [7].

Compreender a ativação e a ação do complexo enzimático calpaína/calpastatina é crucial, pois esse sistema desempenha um papel fundamental na degradação pós-morte das proteínas miofibrilares e na maciez da carne durante o armazenamento [8]. As calpaínas atuam degradando proteínas como titina, nebulina, desmina, troponina e tropomiosina, o que resulta no enfraquecimento da interação entre o filamento fino e o disco Z, ambos constituintes do sarcômero, que é a unidade básica do músculo estriado. Esse processo contribui para a transformação do músculo em carne [9] [10].

A nutrição é um dos fatores que podem influenciar o desempenho das enzimas do sistema calpaína/calpastatina, uma vez que está intimamente ligada à expressão dos genes que regulam esse sistema [11]. A ingestão de determinados alimentos pode bloquear ou ativar a expressão gênica ao longo da vida do indivíduo, e esses processos podem ser monitorados por meio da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), uma ferramenta essencial para a investigação do RNA tecidual. Além disso, a PCR também é amplamente utilizada para diagnósticos em animais e plantas, sendo aplicada em áreas como forense e melhoramento genético, entre outras [12].

O protocolo RT-qPCR, como é conhecido no meio científico, permite a análise quantitativa direta da expressão relativa do RNA, sendo de extrema importância, devido à sensibilidade do gene, que o material da amostra seja de alta qualidade, ou seja, que o RNA não seja degradado ou fragmentado [13]. Portanto, a qualidade do RNA dependerá do ambiente de extração e dos protocolos de coleta utilizados. Após essas adições, a extração do RNA é uma etapa necessária na preparação de métodos para RT-qPCR [14].

Essa abordagem genética e proteômica é atualmente necessária para obter informações sobre os mecanismos relacionados à amaciamento da carne [15], característica de extrema importância segundo o consumidor nacional e segundo pesquisa realizada por [16], avaliando preferências no consumo de carne ovina.

Ao longo desta revisão, serão apresentados diferentes aspectos moleculares relacionados à qualidade da carne, como a ação do sistema calpaína-calpastatina, o papel das caspases e a utilização do RT-qPCR para análise da expressão gênica. Cada um desses tópicos está interconectado, refletindo como os processos moleculares pós-abate e a expressão de genes específicos contribuem para características sensoriais e funcionais da carne, como a maciez.

2. Qualidade da carne

Os consumidores estão desenvolvendo novos hábitos em relação ao consumo de carne de cordeiro e seus derivados. Para garantir uma boa aceitação desse produto, é essencial produzir animais que atendam às exigências do mercado, seguindo padrões de qualidade específicos [17]. A qualidade da carne envolve diversos fatores inter-relacionados, que dependem de todas as etapas da cadeia produtiva, além do modo como o produto é preparado e consumido, destacando a importância de um foco constante no consumidor final.

Entre os fatores que influenciam a aceitabilidade da carne ovina, além dos métodos de produção, estão as características físico-químicas [18]. Um exemplo é o processo de saturação da gordura, que ocorre à medida que o animal envelhece até o abate. Esse processo impacta diretamente o mercado, pois altera o sabor e o aroma da carne, levando os consumidores a desenvolverem uma percepção negativa ao consumir carne de animais mais velhos [19] [20].

Além dessas influências pré-abate, a qualidade final da carne também depende de processos que ocorrem no período post mortem. A maioria das reações que definem a maciez e outras qualidades sensoriais da carne inicia-se após a morte do animal, quando a circulação sanguínea é interrompida, resultando em uma série de alterações bioquímicas no tecido muscular [21]. Esses processos incluem o rigor mortis, que marca a transformação do músculo em carne, e a subsequente degradação proteolítica, que modifica a arquitetura das proteínas estruturais, contribuindo para a maciez da carne [22].

Um fator importante nesses processos é a acidificação do músculo devido à queda do pH no período post mortem. Esse ambiente ácido, com pH em torno de 5,7, ativa as calpaínas, enzimas responsáveis por continuar o processo de amaciamento da carne. Essas enzimas permanecem ativas por aproximadamente 16 horas, desempenhando um papel crucial na manutenção da maciez ao longo do armazenamento [23] [24].

Para a carne de cordeiro, espera-se que o pH final esteja entre 5,5 e 5,8, próximo ao ponto isoelétrico das proteínas [25]. Nesse estágio, a ausência de força atrativa entre as fibras musculares, causada pela neutralização das cargas positivas e negativas, favorece o distanciamento entre os miofilamentos que compõem o tecido muscular [26]. Esse aumento no comprimento dos sarcômeros resulta diretamente em uma carne mais macia. Além disso, a queda rápida de temperatura e pH após o abate acelera as alterações bioquímicas post mortem e intensifica a ação das enzimas proteolíticas sobre os atributos sensoriais da carne [27].

Manter os valores de pH da carne de cordeiro dentro dessa faixa ideal também indica que o abate foi realizado seguindo os padrões adequados de bem-estar animal. Quando essas condições são respeitadas, ocorre o correto desenvolvimento do rigor mortis, que ativa de forma eficiente o sistema calpaína, essencial para o processo de amaciamento da carne [28] [29].

No entanto, a calpastatina, um inibidor natural das calpaínas, desempenha um papel fundamental ao inativar essas enzimas, limitando a degradação das proteínas miofibrilares durante a maturação e, consequentemente, reduzindo a maciez da carne e a ação da calpastatina está diretamente relacionada à velocidade de refrigeração: quando o resfriamento é retardado, a ativação da calpastatina também é postergada [30].

Esse atraso na ativação é mais pronunciado em animais com maior deposição de gordura subcutânea, que atua como isolante térmico. Assim, as calpaínas, responsáveis pelo amaciamento da carne, mantêm sua atividade por mais tempo em temperaturas mais elevadas, enquanto a calpastatina demora mais para exercer sua função inibitória [23] [31].

Dessa forma, o sistema de produção, incluindo a alimentação dos animais, exerce um impacto significativo sobre os aspectos qualitativos da carne, uma vez que afeta diretamente as taxas de crescimento e deposição de gordura. Animais terminados em confinamento, por exemplo, tendem a apresentar maior deposição de gordura em comparação com aqueles terminados a pasto [32] [33]. Esse maior acúmulo de gordura favorece a maciez da carne, devido à ação prolongada das calpaínas, ativadas pelos genes CAPN1 e CAPN2, como mencionado anteriormente, corroborando a importância do manejo alimentar para a qualidade final do produto.

Embora já seja bem estabelecido que a nutrição animal influencia a atividade de enzimas como as calpaínas, ainda há incertezas sobre o quanto a dieta afeta a expressão de genes como CAPN1, CAPN2 e CAST. Estudos mostram que dietas ricas em concentrados e pobres em fibras podem acelerar o processo de crescimento muscular, resultando em maior deposição de gordura, o que pode, por sua vez, modificar a atividade dessas enzimas. No entanto, ainda não é claro se esses mesmos planos nutricionais alteram significativamente a expressão gênica desses marcadores moleculares.

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3. μ-calpaína e m-calpaína: Enzimas fatoradas com cálcio ativadas pelos genes CAPN1 e CAPN2

Durante o processo de amaciamento da carne, o enfraquecimento e desaparecimento dos discos Z nos sarcômeros musculares, que delimitam a unidade funcional das miofibrilas, têm sido associados ao sistema calpaína-calpastatina, especialmente quando suplementado com cálcio (Ca2+). Esse sistema desempenha um papel essencial na degradação das proteínas estruturais do músculo, promovendo o amaciamento da carne [34] [11].

Segundo [35], a identificação e o isolamento de uma protease ativada por Ca2+, que remove os discos Z e promove a ruptura dos filamentos contráteis do músculo, revelaram a atividade enzimática endógena na dissociação da actomiosina. Esse processo é intensificado pelo fornecimento de calor, o que destaca a necessidade de compreender como diferentes tratamentos afetam a dissociação de proteínas específicas.

O sistema enzimático calpaína-calpastatina é composto por duas principais calpaínas: μ-calpaína e m-calpaína. A μ-calpaína é mais sensível à presença de Ca2+, e sua ativação e autólise desempenham um papel crucial em diversos processos intracelulares, incluindo a reestruturação do citoesqueleto, a regulação do ciclo celular, a apoptose e a formação de tecido muscular [36]. Esses processos são fundamentais para o desenvolvimento muscular e têm impacto direto na qualidade final da carne.

Diferentemente de muitas proteases, as calpaínas não degradam totalmente suas proteínas-alvo; em vez disso, realizam clivagens em locais específicos, modulando suas funções [37] [38]. Elas são classificadas como proteases neutras, atuando de forma mais eficiente em pH neutro (7,0 a 7,5) e em temperaturas entre 10°C e 25°C. Além disso, a atividade das calpaínas é dependente de concentrações de cálcio que variam entre níveis micromolares e milimolares, destacando a importância do Ca2+ na regulação de suas funções [39].

Essas alterações promovidas pelas calpaínas nas estruturas miofibrilares levam à redução da rigidez muscular e, como consequência, ao aumento gradual da maciez da carne [40]. Após a morte do animal, quando as reservas de ATP no músculo se esgotam, o Ca2+ não pode mais ser transportado para o retículo sarcoplasmático, o que aumenta sua concentração intracelular. Esse aumento, juntamente com a acidificação da célula devido à queda no pH, ativa as calpaínas, desencadeando o processo de amaciamento da carne.

Estudos confirmam que as μ-calpaínas são ativadas em um intervalo de pH entre 6,8 e 5,7, enquanto as m-calpaínas são ativadas em um pH próximo a 5,7 [41]. No entanto, há evidências de que em pH entre 5,5 e 5,8 a μ-calpaína se torna inativa, tornando essencial a avaliação simultânea das atividades das calpaínas 1 e 2 para obter uma compreensão mais específica de seus papéis no processo de amaciamento da carne [42].

Em estudos com ovelhas de diferentes idades, [43] observaram uma maior expressão do gene CAPN2 na carne de cabras pós-púberes em comparação com a de cabritos recém-desmamados. Em relação ao gene CAPN1, a expressão foi semelhante entre os grupos experimentais, tanto nas cabras recém-desmamadas quanto nas pós-desmamadas. Esses resultados indicam que a idade pode influenciar a expressão de genes envolvidos no sistema calpaína-calpastatina, o que impacta diretamente a qualidade da carne.

Os autores sugerem que animais jovens apresentam uma menor taxa de proteólise, o que está alinhado com sua maior taxa de crescimento muscular. Esse crescimento é atribuído, em parte, à diminuição da degradação de proteínas, resultado do aumento da atividade da calpastatina, que inibe a ação das calpaínas e, consequentemente, reduz a degradação das proteínas miofibrilares [43] [44].

[45] e [46] explicam que a atividade da calpastatina pode ser aumentada em estados de sarcopenia, como consequência do avanço da idade, com o objetivo de controlar a atividade das calpaínas. Entretanto, não há evidências diretas dessas atividades em bovinos e ovinos, pois esses animais são geralmente abatidos antes de atingirem a velhice, o que limita a investigação dessas enzimas em fases mais avançadas da vida.

Nesse contexto, a literatura afirma que animais criados a pasto, especialmente em sistemas mais extensivos, onde são abatidos em idade mais avançada em comparação com animais criados em confinamento, tendem a produzir carne com menor maciez [47] [48] [49]. Essa redução na maciez pode estar relacionada à menor atividade proteolítica das calpaínas nesses animais, uma vez que a maior idade ao abate favorece o aumento da atividade da calpastatina, inibindo a degradação das proteínas miofibrilares.

Em um estudo com bovinos Braford criados sob diferentes planos nutricionais — pasto e pasto suplementado com silagem de milho a 1% do peso vivo por dia — foi observada uma diferença significativa na abundância de RNA do gene CAPN1 entre os diferentes músculos analisados, de acordo com a dieta fornecida. A expressão do gene CAPN1 foi maior no músculo Longissimus dorsi dos animais suplementados. No entanto, não foi encontrada diferença significativa na expressão do gene CAPN2 no mesmo estudo [50].

De acordo com [7], é possível testar os efeitos de uma determinada condição experimental na expressão gênica, permitindo uma visão integrada das mudanças que ocorrem em grupos específicos de genes. Isso possibilita uma compreensão mais ampla dos estágios de desenvolvimento e da forma como uma espécie metaboliza os componentes de uma formulação nutricional. Em experimentos com nutrição, esses dados são essenciais para avaliar como diferentes dietas podem influenciar a expressão de genes como CAPN1 e CAPN2, impactando diretamente a qualidade da carne.

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4. Calpastatina

O gene da calpastatina (CAST) desempenha um papel significativo nas características de crescimento e nas propriedades da carcaça. Sua função principal é ativar a enzima calpastatina que inibe as calpaínas, que degradam a proteína muscular, influenciando diretamente o rendimento, a maciez e a qualidade final da carne [51]. A calpastatina é um membro bem caracterizado do sistema calpaína-calpastatina, inibindo especificamente a atividade proteolítica da µ-calpaína e m-calpaína. A quantidade e a ação da calpastatina no músculo do animal são fatores determinantes na maciez da carne [52].

O sistema calpaína-calpastatina, como todas as proteínas, resulta de sua expressão em nível celular, onde o gene é transcrito em RNA mensageiro e posteriormente traduzido em proteína [53] [54]. A quantidade de calpaína ou calpastatina no tecido muscular pode variar conforme a expressão de seus genes codificadores. No entanto, a quantidade de mRNA expressa nem sempre reflete a quantidade de proteína produzida, devido a regulações pós-traducionais [2]. Isso pode gerar variações nas quantidades de calpaína e calpastatina presentes no período post mortem, afetando o processo de amaciamento da carne.

Além disso, o pH abaixo do ideal pode inibir a atividade enzimática e causar um encurtamento excessivo das fibras musculares, resultando em uma carne mais dura e com menor capacidade de retenção de água. Esse efeito ocorre porque as sequências helicoidais da calpastatina impedem que as calpaínas se liguem às membranas, prejudicando a maciez do músculo vivo. A ação aumentada da calpastatina também reduz a degradação das proteínas musculares, impactando negativamente a maciez final da carne [55].

O cálcio (Ca2+) é essencial para que a calpastatina se ligue e iniba as calpaínas [56]. A ligação entre a calpastatina e as calpaínas é reversível, e a quantidade de cálcio necessária para essa ligação depende da conformação da molécula de calpaína. Curiosamente, a quantidade de cálcio requerida para a ligação calpaína-calpastatina é significativamente menor do que a necessária para iniciar a atividade proteolítica das catepsinas, que degradam proteínas miofibrilares e atuam sobre o colágeno durante a maturação muscular.

Diante desse cenário, a nutrição também pode influenciar a expressão do gene da calpastatina (CAST) [57]. Carcaças com menor deposição de gordura, devido à menor sensibilidade ao frio, e o abate de animais mais jovens impactam a ação geral do sistema calpaína-calpastatina. Esse sistema, regulado pelos genes CAPN1, CAPN2 e CAST, desempenha um papel crucial na determinação da maciez e da qualidade final da carne, mostrando como a nutrição e o manejo dos animais podem modular a atividade dessas enzimas e, consequentemente, influenciar os resultados da produção.

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5. Disparo e ativação da Caspase 3

O período post mortem desempenha um papel crucial na fragmentação da estrutura muscular, afetando diretamente a maciez e a capacidade de retenção de água da carne. No entanto, a proteólise por si só pode explicar apenas uma parte limitada das variações na qualidade do músculo [58] [59]. Estudos de [60] e [52] sugerem que a caspase 3 ativa está associada à degradação de proteínas miofibrilares. A caspase 3 é uma das principais enzimas envolvidas na iniciação e execução da apoptose, um processo fundamental para o desenvolvimento e a manutenção da homeostase tecidual em organismos multicelulares.

As mudanças que ocorrem em células em apoptose são amplamente mediadas por uma cascata enzimática de proteases de cisteína conhecidas como caspases (CASP). As caspases são endoproteases que hidrolisam ligações peptídicas de maneira dependente de resíduos de cisteína catalítica no sítio ativo, e essa reação ocorre apenas após a presença de determinados resíduos de ácido aspártico no substrato [61] [62].

Embora o processamento mediado por caspases possa resultar na inativação de substratos, ele também pode gerar moléculas de sinalização ativas que participam de processos ordenados, como a apoptose. Por essa razão, as caspases foram amplamente classificadas com base em seus papéis na apoptose [63], destacando sua importância em diferentes processos celulares.

Entre as caspases, a caspase 3 é particularmente importante, pois está envolvida na degradação de proteínas miofibrilares e citoesqueléticas, podendo estar relacionada ao processo de amolecimento muscular. Além disso, devido ao seu papel cooperativo com as calpaínas, a caspase 3 também pode contribuir para a renovação muscular [64]. [43] observaram que a expressão da caspase 3 aumenta com a idade do animal, de forma semelhante à proporção calpaína-calpastatina relatada no mesmo estudo, sugerindo uma interação entre esses sistemas no controle da qualidade da carne.

As células expressam seus genes em resposta a mudanças ambientais, especialmente em resposta a moléculas de sinalização extracelular específicas. Quando estimuladas, as células alteram o microambiente ao sintetizar e liberar citocinas, receptores solúveis, enzimas e outras moléculas reguladoras. A resposta celular a esses estímulos depende do contexto e da sequência de sinais que a célula recebe, com múltiplos sinais extracelulares convergindo para influenciar a expressão gênica e, consequentemente, impactando a função celular.

Dado que a expressão gênica é iniciada no nível da transcrição, é amplamente aceito que os destinos celulares são determinados por essa regulação. A ativação celular mediada por citocinas, assim como a própria expressão dessas moléculas sinalizadoras, depende de uma complexa maquinaria molecular que utiliza a transcrição como a principal via de regulação [65]. Esse mecanismo tem implicações diretas para a modulação de processos como a apoptose e a proteólise, impactando diretamente a qualidade da carne.

Além de clivarem os mesmos substratos que as calpaínas, há evidências de que o sistema calpaína-calpastatina e o sistema caspase interagem e atuam em conjunto [66]. É interessante notar que a calpastatina, o principal inibidor das calpaínas, também é um substrato das caspases, especialmente das caspases 3 e 7 [67]. Dessa forma, se as caspases estiverem ativas no músculo post-mortem, elas podem influenciar a qualidade da carne ao degradar a calpastatina, o que resulta em um aumento na quantidade de calpaínas ativas, favorecendo o processo proteolítico [68].

Essa interação entre os dois sistemas enzimáticos sugere que a ativação das caspases no período post-mortem não apenas regula a apoptose, mas também pode facilitar a degradação proteica ao reduzir a inibição das calpaínas. Esse processo contribui diretamente para o amaciamento da carne, impactando suas características sensoriais e a qualidade final.

Embora a caspase 3 não seja uma protease de cisteína dependente de cálcio, o uso de Ca2+ tem sido associado ao aumento da atividade dessa enzima [52]. No contexto das caspases 3 e 7, [69] indicam que essas enzimas são indicadores preferíveis para detectar diferenças que influenciam a qualidade da carne, pois ativam as proteases responsáveis pela transformação muscular. Além disso, esses autores sugerem que a avaliação da apoptose no músculo post-mortem pode representar uma nova abordagem para investigar a influência do manejo animal no metabolismo muscular e na morte celular, com importantes consequências para a qualidade da carne.

Nessa linha, alguns estudos identificaram uma maior expressão da subunidade grande da caspase 3 em amostras de carne bovina do tipo DFD (Dark, Firm, Dry), caracterizadas por uma textura escura, firme e seca, 24 horas após o abate [70]. No entanto, a maciez da carne pode ser considerada um sistema complexo, com uma intrincada rede de proteínas envolvidas no processo de amaciamento [71] [22] [72], reforçando a importância de uma abordagem multifatorial para compreender plenamente os mecanismos que influenciam essa característica sensorial.

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6. RT-qPCR - Genes Endógenos

Para ser considerado um gene normalizador, é necessário que ele apresente uma expressão estável e desregulada no tipo de amostra analisada. Os genes endógenos geralmente atendem a esses critérios, desempenhando um papel crucial na normalização dos resultados experimentais [73]. O uso de um gene normalizador adequado tem grande impacto nos resultados da análise, pois ele deve ter uma expressão significativa e invariável no tecido estudado. Além disso, como a expressão gênica pode ser influenciada por condições metabólicas e fisiológicas, é fundamental avaliar o comportamento desse gene em cada condição experimental [74].

Para que um gene possa ser utilizado como referência, é necessário comprovar sua adequação por meio de experimentos rigorosos, assegurando que ele possua as características necessárias para cumprir sua função de normalização de maneira eficaz [75].

No entanto, é essencial reforçar que a escolha dos genes normalizadores deve ser validada para cada condição experimental específica, uma vez que a expressão desses genes pode variar de acordo com o estado fisiológico ou metabólico dos animais. A seleção de mais de um gene normalizador, como foi feito no estudo de [76] Silva et al. (2023), oferece maior robustez à análise, reduzindo a possibilidade de variações indesejadas nos resultados devido à dependência de um único gene de referência.

Ainda de acordo com [76], foi identificada a combinação dos genes hidroximetilbilanossintase (HMBS) e β-2-microglobulina (B2M) como os normalizadores mais estáveis para a análise da expressão dos genes CASP3, CAPN1, CAPN2 e CAST em músculo de ovinos alimentados com três planos nutricionais diferentes. Embora os genes HMBS e da proteína de ligação à caixa TATA (TBT) pudessem ser utilizados isoladamente como normalizadores, a combinação de HMBS e B2M foi preferida. Isso ocorre porque o uso de um único gene de referência aumenta a probabilidade de variações na expressão, o que poderia comprometer a confiabilidade dos resultados experimentais.

O uso do gene HMBS como normalizador é particularmente interessante na avaliação da expressão gênica em músculo, pois ele está envolvido no metabolismo da porfirina, um pigmento de origem natural. HMBS atua como um intermediário metabólico na biossíntese do grupo heme, essencial para a produção de hemeproteínas [77]. Entre as hemeproteínas, a hemoglobina é uma das mais conhecidas, responsável pelo transporte de O2 no sangue e pela cor vermelha característica do sangue. Outro exemplo importante é a mioglobina, uma proteína sarcoplasmática presente nas fibras musculares. As hemeproteínas desempenham funções cruciais, como a ligação e transporte de oxigênio, transferência de elétrons, catálise e sinalização celular [78].

Além disso, o gene B2M desempenha uma função essencial associando-se à proteína HFE, regulando conjuntamente a expressão de hepcidina no fígado. A hepcidina atua sobre o transportador de ferro, ferroportina, presente na membrana basolateral dos enterócitos e na membrana dos macrófagos, promovendo sua degradação. Esse mecanismo reduz a absorção de ferro dos alimentos e diminui a liberação de ferro reciclado dos glóbulos vermelhos pelo sistema fagocítico mononuclear. A perda dessa função pode resultar em acúmulo excessivo de ferro no organismo, levando a condições como a hemocromatose [79].

Por fim, a proteína de ligação da caixa TATA (TBP) é outro gene com potencial para ser usado como normalizador. TBP é um fator de transcrição (TF) que se liga especificamente à sequência de DNA conhecida como caixa TATA, facilitando a transcrição dos genes. Os fatores de transcrição, como a TBP, desempenham um papel crucial ao permitir a ligação da enzima RNA polimerase ao DNA em células eucarióticas, promovendo a transcrição e, posteriormente, a tradução dos genes [80]. A inclusão de genes como TBP na escolha de normalizadores pode aumentar a precisão na análise da expressão gênica, garantindo maior confiabilidade nos resultados experimentais.

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7. Considerações finais

Estudos mostram que, há anos, o complexo calpaína-calpastatina tem um papel fundamental na proteólise muscular e na transformação do músculo em carne, sendo responsável pela sua qualidade final. No entanto, a expressão dos genes que codificam essas enzimas ainda apresenta resultados divergentes na literatura. Por exemplo, alguns autores associam uma força de cisalhamento consideravelmente maior à carne de animais que expressam o gene CAST, enquanto carnes de animais que não expressam esse gene tendem a ser mais macias.

Por outro lado, alguns estudos não encontraram relação clara entre a maciez da carne e a expressão de genes responsáveis pela proteólise muscular. Embora seja sabido que a nutrição animal interfere na ação das enzimas, ainda não está totalmente claro se essa mesma nutrição afeta a expressão gênica de CAPN1, CAPN2 ou CAST, o que pode variar de acordo com a espécie animal, o momento do estudo ou, principalmente, a raça.

Uma questão importante que emerge da literatura é a divergência nos resultados relativos à expressão de genes, como CAPN1, CAPN2 e CAST, e sua relação com a maciez da carne. Enquanto alguns autores relatam uma associação direta entre a maior expressão do gene CAST e a resistência à maciez, outros não encontraram essa relação. Essas divergências podem ser explicadas por diversos fatores.

Uma possível explicação é a variação nos métodos experimentais, como a diferença no tipo de amostra de carne utilizada, no momento da análise post-mortem ou no tipo de dieta oferecida aos animais. Além disso, fatores como raça, idade e manejo podem influenciar a expressão gênica, o que sugere a necessidade de estudos mais detalhados que controlem essas variáveis. Essas diferenças também indicam que as interações entre a genética, nutrição e manejo ainda não são completamente compreendidas e podem ter um impacto maior do que se conhece.

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8. Biografias

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9. Declaração de Direitos

As autoras declaram ser detentoras dos direitos autorais da presente obra, que o artigo não foi publicado anteriormente e que não está sendo considerado por outra(o) Revista/Journal. Declaram que as imagens e textos publicados são de responsabilidade das autoras, e não possuem direitos autorais reservados à terceiros. Textos e/ou imagens de terceiros são devidamente citados ou devidamente autorizados com concessão de direitos para publicação quando necessário. Declaram respeitar os direitos de terceiros e de Instituições públicas e privadas. Declaram não cometer plágio ou auto plágio e não ter considerado/gerado conteúdos falsos e que a obra é original e de responsabilidade das autoras.

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