Análise da atividade antifúngica in vitro dos óleos essenciais ozonizados e não ozonizados de Eugenia Caryophyllus, Melaleuca Alterniofolia e Pelargonium Graveolens

ARTIGO ORIGINAL

Análise da atividade antifúngica in vitro dos óleos essenciais ozonizados e não ozonizados de Eugenia Caryophyllus, Melaleuca Alterniofolia e Pelargonium Graveolens

Bruno Leonardo Almeida Viana¹; Herbert Lima Batista²; Ana Flávia Machado de Carvalho³

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In vitro analysis of the antifungal activity of ozonized and non-ozonized essential oils from Eugenia Caryophyllus, Melaleuca Alternifolia, and Pelargonium Graveolens.

Abstract

This study aimed to analyze the effectiveness of the antifungal activity of ozonized and non-ozonized essential oils extracted from Eugenia caryophyllus, Melaleuca alternifolia, and Pelargonium graveolens against different strains of pathogenic fungi. The methodology employed included the Agar diffusion method to determine the antifungal

potential of the essential oils. It was an experimental, comparative study with a casual design. The investigation of the antifungal activity of these essential oils was conducted in the bioprocess laboratory of the Federal Institute of Tocantins, Araguaína campus. The oils were stored and refrigerated until use and left at room temperature for 30 minutes before procedures. The results showed differences in the ozoneization of the oils, with clove bud oil exhibiting the highest inhibitory activity. These findings have important implications for the use of essential oils as antifungal agents.

Keywords: Antifungal activity; Chemical analysis; Essential oils; Ozoneization.

1. Introdução

 As plantas medicinais e aromáticas integram grande parte da flora natural e são consideradas um importante recurso em várias áreas, como na indústria farmacêutica, de aromas e fragrâncias, perfumaria e cosmética. Tal fato acarretou um crescimento do emprego de medicamentos à base desses fitoterápicos para o tratamento de inúmeros problemas da saúde humana1.

A planta do cravo-da-índia é comumente cultivada no Brasil e em diversas nações tropicais. No território brasileiro, seu cultivo é predominante no sul da Bahia, onde é regularmente explorada para a extração de óleo essencial, proveniente dos botões florais, folhas e outras partes da planta2. A espécie alternifolia, conhecida como árvore do chá, geralmente floresce em regiões pantanosas e próximas a rios, provém do gênero Melaleuca, pertencente à família Myrtaceae3.

Outra planta medicinal aromática, originária da África do Sul e Austrália, é o gerânio. Seu aroma remete à fragrância da rosa, embora existam outras espécies que imitem diferentes odores. Além de serem cultivados em jardins por razões estéticas, os gerânios têm diversas propriedades medicinais, como ação bactericida, antiespasmódica, antisséptica, adstringente, cicatrizante, diurética, hemostática e tônica para a pele. No passado, era utilizado como remédio para feridas, úlceras e cuidados dermatológicos4.

O uso de compostos com atividade antifúngica deu início a uma nova fase no combate às patologias, reduzindo a taxa de mortalidade e morbidade, porém o consumo acentuado dessas substâncias gerou um elevado grau de resistência aos medicamentos e, consequentemente, a ausência de soluções para combater a patogenicidade dos microrganismos, o que ocasionou uma busca por novas alternativas de tratamento5.

No tocante à atividade fúngica, verifica-se que nem todos os fungos causam problemas à saúde, uma vez que existem alguns que são importantes para a vida do ser humano, como por exemplo, os usados na fermentação para a produção de alimentos e de bebidas, aqueles utilizados na fabricação da penicilina e os cogumelos comestíveis, dentre outros1. Por sua vez, os fungos prejudiciais à saúde devem ser combatidos através de aditivos conservantes antifúngicos que são substâncias usadas com o objetivo de prevenir ou eliminar o desenvolvimento desses microrganismos. Os antifúngicos atuam diretamente na membrana plasmática das células fúngicas, modificando-as e ocasionando sua redução, o que leva à cura do paciente6.

Os óleos essenciais possuem uma vasta gama de compostos voláteis e são conhecidos pelas suas propriedades medicinais, empregadas como agentes antibacterianos, analgésicos, sedativos e anti-inflamatórios, sendo estes uma proposta de terapêutica7. Desse modo, os óleos essenciais são moléculas lipofílicas pequenas e apolares que se caracterizam por sua volatilidade, o que possibilita sua extração através da destilação a vapor e também por outros métodos, tais como a difusão de hidrogenação e pressão 8,1.

Atualmente, algumas das drogas sintéticas disponíveis no mercado não conseguem inibir muitos micróbios patogênicos. Ademais, o uso desses produtos químicos para controlar esses microrganismos é limitado devido a seus efeitos carcinogênicos, toxicidade aguda e potencial de risco ambiental. Nesse sentido, a exploração dos óleos essenciais para controlar este problema é de grande utilidade para combater as enfermidades infecciosas4. Logo, há uma crescente demanda por produtos vegetais de alta qualidade e que não contenham resíduos químicos, levando as pessoas a procurarem produtos com baixa toxidade para o ser humano e que não causem prejuízo ao planeta9.

A ozonoterapia emerge como uma alternativa promissora no tratamento de diversas doenças, oferecendo vantagens distintas em relação aos fármacos convencionais encontrados em farmácias antifúngicas10. Dessa forma, como objetivo geral, o trabalho em questão analisou a eficácia da atividade antifúngica dos óleos essenciais ozonizados e não ozonizados extraídos de Eugenia caryophyllus, Melaleuca alternifolia e Pelargonium graveolens frente à diferentes cepas de fungos patogênicos, utilizando o método de difusão em Ágar, a fim de determinar seus potenciais como agentes.

Portanto, o interesse em pesquisar os efeitos e desenvolver os óleos essenciais ozonizados como agentes antifúngicos é de extrema importância como proposta de tratamento, na tentativa de atender as demandas da saúde pública e ambiental, sendo esta uma alternativa viável e segura para combater enfermidades infecciosas, promovendo simultaneamente a preservação da saúde humana e do meio ambiente. O presente estudo se propõe a analisar de forma abrangente a eficácia dos óleos essenciais ozonizados e não ozonizados de Eugenia caryophyllus, Melaleuca alterniofolia e Pelargonium graveolens. Por meio de uma investigação meticulosa, buscou-se não apenas contribuir para o desenvolvimento de terapias antifúngicas mais eficazes, mas também para o avanço do conhecimento científico em prol da saúde pública e da conservação ambiental.

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2. Metodologia

Trata-se de uma pesquisa experimental e comparativa, cujo delineamento foi mera casualidade. Foi realizada no Laboratório de Bioprocessos do Instituto Federal do Tocantins (IFTO), Campus Araguaína–TO. O efeito da atividade antifúngica dos óleos essenciais de Eugenia caryophyllus, Melaleuca alterniofolia e Pelargonium graveolens foi avaliado pelo método de microdiluição em caldo em placas contendo poços, como descrito pelo M27- A2 (2002) para leveduras. A concentração inibitória mínima (CIM) é determinada após 24 horas. O antifúngico Fluconazol foi utilizado como controle positivo.

Os óleos essenciais foram adquiridos na FERQUIMA Indústria e Comércio Ltda., empresa especializada na venda desses itens, conforme a tabela abaixo, com lotes de procedência conhecida e laudos técnicos, com especificidades que comprovam suas características físico-químicas dentro do padrão de aceitabilidade para os óleos, segundo a literatura e legislação. Os óleos, após aquisição, permaneceram sob refrigeração até o momento do uso, sendo colocados em temperatura ambiente laboratorial cerca de 30 minutos antes de se iniciarem os procedimentos de análises químicas e antifúngica.

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2.1 Ozonização dos óleos

Os óleos essenciais de Eugenia caryophyllus, Melaleuca alterniofolia e Pelargonium graveolens receberam a ozonização por meio de difusão do O3, administrado de forma direta no óleo conforme descrito a seguir.

Figura 1 - Imagens da ozonização do óleo essencial. Fonte: Autor (2023).

A produção do ozônio foi realizada através de um aparelho gerador, cor branca, modelo MOG003, da marca Ozone Generator, que produz descargas elétricas sob O2 medicinal (efeito Corona), proveniente de um cilindro industrial, da marca AIR GAS Health Solution, com especificações ONU 1072 oxigênio, comprimido 2.2 (5.1) e grau de concentração 99,5% vol., que abastece o aparelho, liberando o O3 em uma concentração de 20 µg/ml, segundo as especificações do equipamento fornecido pela fabricante, que realiza a conversão de oxigênio medicinal em ozônio.

O gás rico O3, produzido continuamente pelo aparelho numa taxa de 1/2 litro por minuto, é conduzido por um tubo de silicone para um difusor, que mergulhado no óleo vegetal ou óleo essencial é perfundido por 30 minutos. A temperatura dos óleos essenciais durante a perfusão foi controlada de 5°C com um banho ultratermotizado, com intuito de diminuir a perda por evaporação dos óleos essenciais, como exposto na Figura 1.

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2.2 Caracterização química dos óleos

Tabela 1 - Nomes vulgar e científico das plantas medicinais e características dos óleos essenciais

*Nº CAS: Chemical Abstracts Service

**IR: Índice de Refração. Fonte: FFERQUIMA Indústria e Comércio Ltda (2023).

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2.3 Atividade Antifúngica

2.3.1 Linhagens fúngicas e meio de cultura

O ensaio antifúngico foi conduzido com fungos de estirpes padronizadas e provenientes de coleção internacional, de acordo com o método de referência para testes de diluição em caldo para determinação da sensibilidade a terapia antifúngica de leveduras11.

Tabela 2 - Cepas de fungos utilizadas nos ensaios antifúngicos.

Fonte: Catálogo de Linhagens, Laboratório Microbiologics, INC., 2022.

Os fungos, tabela 2, foram adquiridos no Laboratório Microbiologics, INC., o qual está licenciado a usar marcas de catálogo ATCC®, com laudos de autenticidade e de procedimentos (Anexo Y) e mantidas no laboratório do Bioprocesso do IFTO Campus Araguaína-TO, conforme recomendação do Microbiologics, INC., em meio de cultura Muelle Hinton. Para os ensaios, as suspensões dos fungos utilizados foram provenientes da primeira passagem (repique) das estirpes recebidas pelo laboratório do IFTO.

O meio de cultura utilizado foi o Ágar Sabouraud Dextroxe, marca ION, Lote 0719/0354, cuja composição em um preparo de 65g/L: Dextrose: 40 g/L; Digestão peptídica de tecido animal: 5g/L; Digestão pancreática de caseína: 5 g/L; Ágar: 15 g/L; pH Final: 5.6 ± 0.2 a 25°C. O preparo do meio foi realizado conforme instruções descritas pelo fabricante, no qual foi necessário suspender 65g do meio em 1L de água destilada. Agitou-se adequadamente e dissolveu-se o meio por aquecimento e frequente agitação. Ferveu-se por 1 minuto até a completa dissolução. Esterilizou-se em autoclave a 118°C - 121°C por 15 minutos. Evitou-se o superaquecimento, pois facilitou-se a hidrólise dos componentes do meio. O meio preparado foi armazenado entre 8°C a 15°C e em seguida, levado para análises microbiológicas.

Figura 2 - Meios de cultura com ensaios antifúngicos dos microrganismos testados com os óleos essenciais. A: Cultura Issatchenkia orientalis ATCC® 6258™. B - Cultura Candida parapsilosis ATCC® 22019™. C – Cultura Candida tropicalis ATCC® 750™. D – Cultura Candida albicans ATCC® 90028™.

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2.2.2 Análise fúngica dos óleos essenciais

O uso dos testes de atividade antifúngica “in vitro” é uma prática usual, inicialmente padronizada para uso com bactérias por Kirby e Bawer desde 1966, porém o uso em atividades fúngicas foi revisto e modificado por diversos autores. Atualmente são adotados métodos padronizados por diversos organismos como: NCCLS - National Committee for Clinical Laboratory Standards, como Método de Referência para Testes de Diluição em Caldo para a Determinação da Sensibilidade de Leveduras; à Terapia Antifúngica; Approved Guideline”, norma M27-A2, 2002, que foi seguido realizando-se pequenas adaptações conforme discutidas abaixo.

Uma quantidade de 1ml de cada óleo essencial foi solubilizada em solução de Dimetil-Sulfoxido (DMSO) em água 1:1 e posteriormente diluída, obtendo respectivamente uma concentração de óleos de 4, 2, 1, 0,5 e 0,25%. Estes extratos diluídos  ​​​​ foram  ​​​​ submetidos  ​​​​ aos  ​​​​ testes fúngicos, em placas estéreis de 20x150mm, em que era depositado 1mL de solução fisiológica contendo microrganismos em suspensões (solução salina a 0,85%NaCl), padronizada pelo tubo 0,5 na escala de Mac Farland, ajustada para 90% transmitância (530nm). Em seguida, eram adicionados por placa 50mL de meio sólido Ágar Sabouraud Dextroxe, preparados segundo as normas do fabricante (ION), fundido a 50ºC, utilizando a técnica “Pour Plate”, homogeneizadas pela técnica de “oito”12,13. O processo de análise fúngica em sua totalidade foi aduzido em uma capela de exaustão da marca BSTEC, na tentativa de diminuir os perigos de aspiração, assim seguindo as normas internacionais de segurança14.

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2.2.3 Análise Química dos óleos essenciais ozonizados e não ozonizados

A partir dos óleos de cravo botão, gerânio egito e melaleuca, ozonizados e não ozonizados, foram preparadas soluções de 20 mg/mL em acetato de etila. Essas amostras foram analisadas em um cromatógrafo a gás Agilent Technologies 7890B, hifenizado a um espectrômetro de massas (GC-MS) 5977B. O cromatógrafo operou com colunas capilares HP-5MS (5% Fenil Metil Siloxano), L = 30 m, DI = 0,25 mm e filme = 0,25 µm e o gás de arraste utilizado foi o Hélio (99.999%) com fluxo de 1.2 mL/min. O GC-MS foi empregado com temperatura do injetor em 270ºC, da transfer line em 250ºC, do quadrupolo em 150ºC e da fonte 230ºC, com o fluxo da purga em 100 mL/min.

O modo de análise foi o Split em modo scan, com uma razão de divisão de 80:1 e uma varredura de 40 até 500 Da. O programa de temperatura do forno do GC foi definido inicialmente em 40ºC por 2 min e aumentou em 5ºC por minuto até 170ºC, seguindo por um adicional de 25ºC por minuto até 270ºC, que foi mantido em isoterma por 3 minutos. No total as corridas duraram 35 minutos.

Os espectros de massa obtidos foram analisados em software da Agilent, MSD ChemStation F.01.03.2357 e comparados com espectros presentes em Adams (2017), juntamente com o índice de similaridade. Os índices de retenção (IR) foram determinados utilizando uma série homóloga de n-alcanos, C7 a C30, injetados no mesmo método das amostras, utilizando a equação de Van den Dool e Kratz de 196315.

Figura 3 - Cromatógrafo Gasoso com Espectrômetro de Massa (CG-EM), Universidade Federal Norte do Tocantins. Fonte: Autor (2023).

Após realização das análises cromatográficas, os valores determinados das áreas relativas de cada composto identificado, foram geradas tabelas em Excel que processaram essa matriz de dados e converteu-se para o formato ".csv" para o estudo estatístico em Análise de Agrupamento de Hierárquico (HCA), Análise de Componentes Principais (PCA) e Análise Discriminante por Mínimo Quadrados Parciais (PLS-DA). Para validação da estatística, foi utilizado o software online MetaboAnalyst 5.0, que possibilitou a geração de representações gráficas das matrizes de dados. Para normalização das áreas dos óleos ozonizados e não ozonizados de cravo botão, gerânio egito e melaleuca, utilizando como transformação de dados a escala de intervalo (range scaling).

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3. Desenvolvimento e discussão

3.1 Atividade Fúngica

Este trabalho constituiu-se em uma avaliação da sensibilidade e ou resistência dos óleos essenciais de gerânio egito, melaleuca e cravo botão ozonizados e não ozonizados em diferentes concentrações frente a fungos conhecidos internacionalmente de coleção ATCC, utilizando a técnica de difusão em ágar.

A análise estatística por ANOVA (análise de variância), apresentou-se significativa para todas as possíveis variáveis empregadas. Verificou-se que existem médias com comportamentos idênticos ou aproximados dentro dos eventos, sugerindo-se que os óleos nas respectivas concentrações, ozonizados ou não, devem ser analisadas de duas a duas, utilizando o Teste de Tukey, chamado também de Teste de Amplitude Estudentizadas16.

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Tabela 3 - Resultado da sensibilidade antifúngica dos óleos essenciais de Gerânio Egito, Cravo Botão e Melaleuca com óleos ozonizados.

Todos os resultados positivos foram significativos quando utilizados o teste T em comparação com o Fluconazol, chamado de controle positivo, inclusive para as diluições (p< 0,05; IC:95%). Os ensaios para o líquido diluidor (solvente) não demonstraram inibição dos microrganismos testados. Médias seguidas de uma mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na linha não se diferem estatisticamente, a um nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. Fonte: Resultados da pesquisa (2023).

Os resultados apresentados (Tabela 3 e 4), revelam que a ozonização dos óleos essenciais de gerânio egito, cravo botão e melaleuca, apontaram resultados significativos que demonstraram ser estatisticamente diferentes. O óleo ozonizado produz maior inibição do crescimento dos fungos que o óleo não ozonizado, quando comparado às médias dos halos de inibição. O óleo de cravo botão possui maiores halos de inibição que o óleo de melaleuca, sendo que a melaleuca possui maiores halos de inibição que o gerânio egito, quando comparado às médias dos comportamentos dos halos de inibição. ​​ Verificou-se que o óleo de cravo botão ozonizado foi mais efetivo para inibir o crescimento da Candida parapsilosis ATCC® 22019™ na diluição de 1%, e na menor diluição de 0,5% a Candida albicans ATCC® 90028™.

O óleo de gerânio egito ozonizado demonstrou-se pouco eficaz na maioria dos fungos, tendo ação inibitória apenas na diluição 4% na Candida albicans ATCC® 90028™.

Tabela 4 - Resultado da sensibilidade antifúngica dos óleos essenciais de Gerânio Egito, Cravo Botão e Melaleuca com óleos não ozonizados.

Todos os resultados positivos foram significativos quando utilizados o teste T em comparação com o Fluconazol, chamado de controle positivo, inclusive para as diluições (p < 0,05; IC:95%). Os ensaios para o líquido diluidor (solvente) não demonstraram inibição dos microrganismos testados. Médias seguidas de uma mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na linha não se diferem estatisticamente, a um nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey

Quanto aos óleos essenciais não ozonizados, verificou-se nenhum efeito antifúngico para nenhuma diluição do gerânio egito e melaleuca. Para o óleo essencial de cravo botão não ozonizado a função antifúngica foi eficaz na diluição de 2% e 4% nas quatro diferentes amostras de fungos deste estudo. O fluconazol mostrou-se eficaz para todas as amostras utilizadas, demonstrando seu efeito antifúngico como já reconhecido por várias literaturas científicas.

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3.2 Análise Química dos óleos Essenciais

3.2.1 Análise Química do óleo essencial do Cravo botão.

A identificação de compostos químicos nas amostras de óleo ozonizado e não ozonizado do cravo botão foi semelhante, em análise realizada por CG-MS, obtendo os compostos majoritários: Eugenol; m-eugenol; Acetato de eugenol; E-cariofileno; α-humuleno e Óxido de cariofileno. O composto α-humuleno no óleo essencial ozonizado apresentou concentração centesimal não detectável.

Figura 4 – Estrutura química dos compostos majoritários contido nos óleos essenciais de Cravo botão “Ozonizado” e “Não Ozonizado”Fonte: ChemDraw Professional 16.0 (2023).

Em seguida, é apresentado o cromatograma dos óleos de cravo botão, conforme a Figura 5, no qual se observa que o óleo "Não Ozonizado" é representado em preto, enquanto o óleo "Ozonizado" é destacado em azul. Adicionalmente, são indicados os principais compostos presentes em cada um dos óleos.

Figura 5 – Comparação dos óleos de cravo botão ozonizado e não ozonizado. Preto: não ozonizado; Azul: ozonizado. Fonte: Resultados da Pesquisa (2023).

Após serem identificados, os componentes foram quantificados utilizando a área sob os picos nos cromatogramas, conforme representado na Figura 5.

Tabela 5 - Identificação dos compostos presentes no óleo de cravo botão ozonizado e não ozonizado.

N°: ordenação dos compostos por eluição; TR: tempo de retenção dos compostos; IRexp: Índice de retenção experimental; IRlit = Índice de retenção da literatura; %: Área percentual dos compostos com base na normalização das áreas por GC-MS; OCO: óleo de cravo ozonizado; OCI: óleo de cravo não ozonizado; Ref: referência. Fonte: Resultados da pesquisa (2023).

Isso permitiu a detecção e análise de cada composto individual. Possibilitou também a determinação da quantidade relativa de cada composto químico nos óleos essenciais de Cravo botão, tanto o "Ozonizado" quanto o "Não Ozonizado". Os resultados da análise indicam que os óleos essenciais possuem composições diferentes em termos de proporções percentuais de seus componentes. Em outras palavras, a ozonização causa alterações na composição do óleo essencial, como detalhado na Tabela 5.

Figura 6 – Resultados da análise dos componentes principais – PCA do óleo essencial do cravo ozonizados e não ozonizado. A – Score dos valores entre os compostos selecionados, com valores das variâncias estendidas, Figura B – Plotagem do gráfico da dispersão central das análises dos componentes principais - PCA. Fonte: Resultados da Pesquisa (2023).

Ao analisar a média das áreas dos picos nos cromatogramas dos óleos essenciais "ozonizado" e "não ozonizado", que representam as análises percentuais de cada óleo, é evidente que exibem proporções distintas. A ozonização não teve um efeito estatisticamente significativo na quantidade dos compostos eugenol e m-eugenol. Através da aplicação da análise multivariada de componentes principais (PCA), ficou evidente que o óleo essencial "Ozonizado" difere estatisticamente do óleo "Não Ozonizado" quando consideramos todos os compostos presentes. Isso é ilustrado na Figura 6 apresentada acima.

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3.2.2 Análise Química do óleo essencial de Melaleuca.

​​ α-tujeno  ​​​​  ​​​​ Sabineno  ​​ ​​​​ 

Figura 7 – Estrutura química dos compostos majoritários contido nos óleos essenciais de Melaleuca “Ozonizado” e “Não Ozonizado”. Fonte: ChemDraw Professional 16.0 (2023).

Figura 8 – Comparação dos cromatogramas do óleo de melaleuca ozonizado (azul) e não ozonizado (preto). Fonte: Resultados da Pesquisa (2023).

Os resultados da análise indicam que os óleos essenciais possuem composições diferentes em termos de proporções percentuais de seus componentes. Em outras palavras, a ozonização causa alterações na composição do óleo essencial, como detalhado na Tabela 6.

Tabela 6 – Identificação dos compostos presentes no óleo de melaleuca ozonizado e não ozonizado

Fonte – Resultados da pesquisa (2023).

Ao analisar-se a média das áreas dos picos nos cromatogramas dos óleos essenciais de melaleuca "ozonizado" e "não ozonizado", que representam as análises percentuais de cada óleo, é evidente que exibem proporções distintas.

Figura 9 – Resultados das análises dos componentes principais. A - PCA do óleo essencial de Melaleuca “Ozonizado” e “Não Ozonizado”. B - Score dos valores entre os compostos selecionados com valores das variâncias estendidas e Plotagem do gráfico da dispersão central das análises dos componentes principais - PCA. Fonte: Resultados da pesquisa (2023).

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3.2.3 Análise Química do óleo essencial de Gerânio egito.

Figura 10 – Estrutura química dos compostos majoritários contido nos óleos essenciais de Gerânio egito “Ozonizado” e “Não Ozonizado”. Fonte: ChemDram Professional 16.0 (2023).

No cromatograma dos óleos de gerânio, conforme a figura 10, observa-se que o óleo "Não Ozonizado" é representado em preto, enquanto o óleo "Ozonizado" é destacado em azul.

Figura 11 – Comparação dos cromatogramas do óleo de gerânio egito ozonizado (azul) e não ozonizado (preto). Fonte: Resultados da pesquisa (2023).

Os resultados da análise indicam que os óleos essenciais possuem composições diferentes em termos de proporções percentuais de seus componentes. Em outras palavras, a ozonização causa alterações na composição do óleo essencial, como detalhado na Tabela 7.

Tabela 7 - Identificação dos compostos presentes no óleo de gerânio egito ozonizado e não ozonizado.

TR: tempo de retenção dos compostos; IR(exp): Índice de retenção experimental; IR(lit) = Índice de retenção da literatura; %: Área percentual dos compostos com base na normalização das áreas por GC-MS; G1: óleo de gerânio não ozonizado; G2: óleo de gerânio egito ozonizado; IS (%): índice de similaridade. Fonte: Resultados da pesquisa (2023).

Ao analisarmos a média das áreas dos picos nos cromatogramas dos óleos essenciais "ozonizado" e "não ozonizado", que representam as análises percentuais de cada óleo, é evidente que exibem proporções distintas.

A

B

Figura 12 – Resultados das análises dos componentes principais - PCA do óleo essencial de Gerânio “Ozonizado” e “Não Ozonizado” b. Figura A e B respectivamente: Score dos valores entre os compostos selecionados com valores das variâncias estendidas e Plotagem do gráfico da dispersão central das análises dos componentes principais - PCA. Fonte: Resultados da Pesquisa (2023).

Figura 13 – Score dos valores entre os compostos selecionados com valores das variâncias estendidas. Fonte: Resultados da Pesquisa (2023).

Inicialmente verificou-se que o óleo essencial ozonizado tem um efeito antifúngico mais eficaz que o óleo não ozonizado. Estudos têm demonstrado que a ozonização pode aumentar significativamente a atividade antimicrobiana de óleos essenciais contra diferentes patógenos, incluindo fungos. Por exemplo, a ozonização do óleo essencial de Origanum vulgare resultou em um aumento significativo da atividade antifúngica contra Candida albicans. De forma semelhante, a ozonização do óleo essencial de Melaleuca alternifolia levou a um aumento na atividade antifúngica contra Aspergillus niger e Trichophyton rubrum17.

O óleo ozonizado produz maior inibição do crescimento das leveduras que o óleo não ozonizado, quando comparado às médias dos halos de inibição, sendo os valores destas de 5,236a1 e 2,722a2, respectivamente (DMS-Diferença Média Significativa: 0,587095107980051; r-repetições=360; EP - Erro Padrão: 0,211423; ANOVA, Tukey; P<0,05; IC:95%).

O óleo de cravo botão apresentou maiores halos de inibição que óleo de melaleuca, sendo que a melaleuca possui maiores halos de inibição que o gerânio egito, quando comparado às médias dos comportamentos dos halos de inibição, sendo 7,375a1; 3,508a2 e 1,054a3 respectivamente (DMS: 0,860416338319318; r=240; EP: 0,25895; ANOVA, Tukey; P<0,05; IC:95%). Nisto o cravo botão foi melhor que o de melaleuca, o qual foi melhor que o gerânio egito.

A média do tamanho dos halos de inibição do crescimento das leveduras durante o ensaio de difusão em ágar manteve uma correspondência direta para as concentrações utilizadas nos ensaios até uma concentração de 0,5% dos óleos essenciais diluídos no solvente, com resultado médio de 9,79mma1 para 4%; 6,53mma3 para 2%; 2,69mma2 para 1%. Já a concentração de 0,5% obteve um halo médio de 0,89mma1, enquanto para 0,25% a média foi de 0,0mm, revelando um comportamento idêntico estatisticamente (DMS: 0,334299675235212; r=144; EP: 0,3342997; ANOVA, Tukey; P<0,05; IC:95%).

Segundo alguns autores pesquisados, verificou-se que dentre os óleos essenciais estudados cientificamente, destacam-se os óleos de Eugenia caryophyllus, Melaleuca alternifolia e Pelargonium graveolens, que apresentam alta eficácia contra diferentes espécies de fungos, incluindo Candida albicans, Candida tropicalis, Candida parapsilosis e Issatchenkia orientalis. Desse modo, os estudos de Silva, no ano de 2021, demonstraram que o óleo essencial de Eugenia caryophyllus é composto principalmente por eugenol, um composto fenólico com atividade antifúngica, o que corrobora com o achado cromatográfico realizado no presente estudo18.

​​ Estudos in vitro têm demonstrado que o óleo essencial de Eugenia caryophyllus apresenta atividade significativa contra várias espécies de candida e outras leveduras, inclusive as que são resistentes aos antifúngicos convencionais, sendo afirmativo o achado encontrado na pesquisa com óleo essencial de cravo botão não ozonizado e ozonizado. Reforçando o entendimento de que o óleo de cravo botão é um eficaz antifúngico, HSU et al., no ano de 2021, relataram em seus estudos que o eugenol é responsável pela atividade antifúngica do óleo essencial de cravo, atuando diretamente na membrana celular dos fungos e inibindo a síntese de ergosterol, um componente essencial da membrana celular fúngica. Além disso, o eugenol também inibe a produção de enzimas essenciais para a sobrevivência dos fungos, como a quitina sintase, inibindo assim o crescimento e a proliferação desses microrganismos19.

O segundo óleo essencial ozonizado foi o de Melaleuca alternifólia. Ele mostrou-se eficaz como antifúngico, segundo as pesquisas, conforme a cromatografia e corroborando com a afirmativa20,21,22, aduzem que a composição química do óleo essencial pode variar, mas geralmente é composto principalmente por monoterpenos, com terpinen-4-ol como o principal composto bioativo responsável pela atividade antifúngica. Além disso, a proporção de terpinen-4-ol em relação aos demais compostos do óleo essencial também pode influenciar a atividade antifúngica.

Os pesquisadores23 investigaram a composição química do óleo essencial de Pelargonium graveolens e sua atividade antifúngica. Um estudo identificou o geraniol como o principal componente do óleo essencial de gerânio e mostrou que este composto exibiu atividade antifúngica contra Candida albicans e outras cepas de candida em concentrações tão baixas quanto 0,125%. Outro estudo comparou a atividade antifúngica do óleo essencial de Pelargonium graveolens com a do fluconazol, um antifúngico sintético amplamente utilizado. Os resultados mostraram que o óleo essencial de gerânio foi tão eficaz quanto o fluconazol contra Candida albicans e Candida glabrata em concentrações de 0,25% e 0,125%, respectivamente24. Além disso, estudos também sugerem que o óleo essencial de gerânio pode inibir a formação de biofilmes fúngicos, o que pode aumentar a eficácia do tratamento antifúngico25.

Mesmo com toda literatura cientifica pesquisada, e corroborando com alguns autores acima, encontrou-se na pesquisa uma atividade antifúngica de baixíssima eficácia, em que não houve formações de halos de inibição de forma satisfatória, com exceção do óleo essencial de gerânio egito ozonizado diluição 4% contra a Candida albicans apenas.

Evidenciou-se no estudo que o óleo essencial não ozonizado de melaleuca e de gerânio egito foram ineficazes na inibição dos microrganismos, uma vez que eles não produziram halos de inibição para nenhuma das quatro leveduras analisadas. Já o óleo essencial de cravo obteve atividade inibitória dos microrganismos. No tocante a ozonização, o óleo essencial de cravo apresentou uma maior atividade do que o não ozonizado, que inibiu somente com diluições maiores.

O óleo de cravo botão ozonizado foi mais efetivo para inibir o crescimento da Candida parapsilosis ATCC 22019 e Candida albicans ATCC 90028, quando comparado ao tamanho do halo de inibição, entretanto o primeiro precisou de uma diluição de 1% e o segundo 0,5%. Quando comparado à levedura de Candida tropicalis ​​ ATCC 750 com a Isatchenkia orientalis ATCC 6258, são estatisticamente idênticas as inibições, quanto ao tamanho do halo.

A ozonização do óleo essencial de melaleuca obteve, estatisticamente, a mesma atividade para todos os microrganismos testados. O óleo de gerânio egito ozonizado com diluição de 4% foi o único que demonstrou ter atividade antifúngica, ocasionando um halo de inibição na Candida albicans, estaticamente comparável ao halo de inibição do óleo essencial de melaleuca nesta mesma levedura. ​​ 

A elevada concentração dos óleos gerou níveis mais intensos de inibição nos inóculos, contribuindo para a determinação da concentração mínima inibitória. Os resultados evidenciaram que o óleo de cravo ozonizado apresentou maior eficácia inibitória em comparação com o não ozonizado. Este estudo, por conseguinte, estabelecerá uma fundamentação para futuras investigações relacionadas ao tema, sendo ainda prevista a realização de um estudo in vivo.

4. Considerações finais

 O estudo revelou que os óleos essenciais não ozonizados de melaleuca e gerânio do Egito não foram eficazes na inibição dos microrganismos testados, enquanto o óleo essencial de cravo apresentou atividade inibitória. A ozonização do óleo de cravo resultou em maior eficácia na inibição dos microrganismos em comparação com o não ozonizado, especialmente contra Candida parapsilosis e Candida albicans. O óleo de gerânio do Egito ozonizado a 4% mostrou atividade antifúngica contra Candida albicans, e o óleo de melaleuca ozonizado e não ozonizado, sendo que esta não apresentou nenhuma resposta inibitória. A concentração elevada dos óleos essenciais contribuiu para determinar a concentração mínima inibitória. Esses resultados estabelecem uma base para futuras investigações, incluindo estudos in vivo.

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5. Declaração de direitos

 O(s)/A(s) autor(s)/autora(s) declara(m) ser detentores dos direitos autorais da presente obra, que o artigo não foi publicado anteriormente e que não está sendo considerado por outra(o) Revista/Journal. Declara(m) que as imagens e textos publicados são de responsabilidade do(s) autor(s), e não possuem direitos autorais reservados à terceiros. Textos e/ou imagens de terceiros são devidamente citados ou devidamente autorizados com concessão de direitos para publicação quando necessário. Declara(m) respeitar os direitos de terceiros e de Instituições públicas e privadas. Declara(m) não cometer plágio ou auto plágio e não ter considerado/gerado conteúdos falsos e que a obra é original e de responsabilidade dos autores.

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