Avaliação da eficácia da inativação térmica de veneno Botrópico em resíduos de ensaios de potência de soro Antibotrópico

ARTIGO ​​ ORIGINAL

Avaliação da eficácia da inativação térmica de veneno Botrópico em resíduos de ensaios de potência de soro Antibotrópico

Fábio Henrique Dias Martins Lima¹; Gabriele Fátima de Souza²; Maria Aparecida Affonso Boller³; Elizabeth Porto Reis Lucas⁴; Armi Wanderley da Nóbrega⁵

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Evaluation of the efficacy of thermal inactivation of Bothropic Venom in residues from potency assays of Antibothropic serum

Abstract

Quality control of botropic antivenom produced for the National Immunization Program mandates potency testing, generating waste that requires safe and efficient disposal. To evaluate the efficacy of the inactivation process for these residues, an experimental study was conducted. Samples of residues from the handling of botropic venom were subjected to autoclaving for 60 minutes at 121°C. Following treatment, residual toxicity was assessed. The results demonstrated that autoclaving under the specified conditions achieved the complete inactivation of botropic venom in aqueous solutions, ensuring the safety of disposal and compliance with biosafety standards. It is concluded that the inactivation protocol adopted by the institution is effective in eliminating the risk associated with the residues generated during potency tests of botropic antivenom, thereby contributing to the safety of personnel involved and environmental protection

Keywords/Palabras clave: ​​ Biosafety; bothrops; toxicity.

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1. Introdução

O envenenamento por picadas de serpente constitui um grave problema de saúde pública em escala global, sendo frequentemente negligenciado por autoridades em diversos países [1, 2, 3]. Estima-se que cerca de 80% das mortes causadas por acidentes com animais peçonhentos sejam atribuídas a picadas de serpentes, seguidas de acidentes com escorpiões, responsáveis por aproximadamente 15% dos casos. [4]

Serpentes do gênero Bothrops são as principais responsáveis pela morbidade causada por serpentes peçonhentas no Novo Mundo. Dados epidemiológicos mais recentes sobre acidentes com animais peçonhentos no Brasil, referentes ao ano de 2023, revelam a notificação de 25.252 casos envolvendo serpentes peçonhentas, sendo que cerca de 86% desses casos são atribuídos ao gênero Bothrops [5].

No Brasil, soros antiofídicos são produzidos em laboratórios públicos, sob a forma de preparações injetáveis líquidas, a partir do plasma de equinos hiperimunizados com venenos específicos. A distribuição desses soros aos hospitais é gratuita, por meio do Programa Nacional de Imunização (PNI) [6].

O controle de qualidade de todos os lotes de soros antiofídicos distribuídos à população é de responsabilidade do laboratório oficial do Ministério da Saúde. Para garantir a padronização desse controle, tanto na produção quanto na avaliação oficial, utiliza-se o veneno botrópico de referência nacional, o mesmo empregado pelos laboratórios públicos [6, 7]

A instituição pública objeto deste estudo é responsável pela guarda e envio aos produtores nacionais do veneno botrópico de referência, em frascos contendo o liofilizado, para utilização nos ensaios de potência necessários à liberação dos lotes de soros antibotrópicos, atendendo assim à demanda do Programa Nacional de Imunização. Diante disso, o descarte dos resíduos gerados nesses ensaios deve seguir rigorosamente as boas práticas de laboratório e os procedimentos técnicos de biossegurança.

Considerando a escassez de literatura e de pesquisas nessa área, além da relevância da temática no contexto atual, este estudo tem como objetivo analisar os procedimentos de descarte dos resíduos provenientes dos ensaios que utilizam o veneno botrópico de referência nacional.

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2.  Metodologia

O presente estudo teve como objetivo avaliar a eficácia de um processo de inativação da toxicidade do veneno botrópico de referência nacional (BraBot/005) por meio de autoclavagem. Para tanto, foram utilizados resíduos provenientes de ensaios de rotina realizados em laboratórios de controle de qualidade de soros antiofídicos, tais como a determinação da potência do soro e a determinação da dose letal 50% (DL50) do veneno.

O Veneno Botrópico de Referência Nacional (BraBot/005) é um padrão de referência liofilizado, obtido a partir da extração do veneno de diversas serpentes Bothrops jararaca, capturadas em diferentes estados brasileiros. A preparação apresenta uma concentração proteica média de 907,60 mg/mg, com um desvio padrão de 40,30 mg/mg. A análise por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) a 7,5% revelou um perfil proteico característico, com 12 bandas distintas. As principais bandas proteicas apresentaram massas moleculares de aproximadamente 14,4, 18, 28, 32 e 62 kDa. [7].

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2.1  ​​ ​​​​ Preparação de soluções

Foram preparadas soluções contendo veneno botrópico de referencia nacional (Brabot/005), soro fisiológico a 0,85% (solução de cloreto de sódio a 0,85%) e soro antibotrópico produzido por laboratório público brasileiro. Para a pesagem do veneno BraBot/005 foi utilizada uma balança analítica (Shimadzu®, modelo AY 220, série D305600158) devidamente calibrada.

A dose do veneno utilizada no Ensaio de Determinação da Potência do Soro Antibotrópico equivale a 5x a Dose Letal 50% (5DL50) fixas em cada diluição preparada, ou seja, aproximadamente 201,45 µg/0,5mL por camundongo em todas as diluições utilizadas.

Para o Ensaio de Determinação da Dose Letal Média (DL50) as doses do Bravot/005 foram formuldas em 5 diluições contendo: 62,2; 51,8; 43,2; 36 e 30 µg/0,5mL por camundongo.

Os ensaios de determinação da potência do soro antibotrópico e da dose letal média (DL50) do veneno botrópico, foram realizados de acordo com os métodos farmacopeicos estabelecidos na Farmacopeia Brasileira [7].

Já no ensaio de Avaliação da Inativação da Toxicidade do Brabot/005 concentrado (1mg/mL) foi preparada um solução contendo a concentração de 1mg/mL, sendo a dose de 500 µg/0,5mL por camundongo.

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2.2 Animais

 Os animais utilizados em todos os ensaios foram camundongos (Mus musculus), da linhagem Swiss Webster, sendo fornecidos pelo Institudo de Ciências e Tecnologia em Biomodelos (ICTB) da Fiocruz.

 Antes dos ensaios, os camundongos foram submetidos a um período de aclimatação de 5 dias. Os animais foram alojados em caixas individuais de polipropileno (29 x 12 x 17 cm), em grupos de até 5 indivíduos, com enriquecimento ambiental e acesso contínuo a água e ração (CR1 Nuvital®). As caixas foram mantidas em prateleiras ventiladas em um ambiente com controle de temperatura (22 ± 3°C), umidade (55 ± 10%) e ciclo claro-escuro de 12 horas. Todos os procedimentos experimentais seguiram os protocolos aprovados pelo Comitê de Ética em Uso de Animais de Laboratório da Fundação Oswaldo Cruz (CEUA/FIOCRUZ - Licença LW-26/17).

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2.3 Ensaio de Determinação da Potência do Soro Antibotrópico

 Foram realizados 3 ensaios amostras distintas- A, B e C - (amotras de Soros Antibotrópicos cujos lotes de fabricação são diferentes) que foram submetidas ao controle de qualidade. Em cada ensaio há um controle positivo e uma amostra teste. Na amostra teste foram preparadas 4 diluições contendo um volume fixo de veneno Brabot/005 ​​ (201,45 µg/0,5mL por animal), diferentes doses de soro antibotrópico (42,41; 32,23; 24,79 e 19,18 µg/0,5mL por animal) e solução fisiológica a 0,85% para ajuste de volume e concentração em grupos de 8 animais e para o controle positivo, foram utilizados 10 animais contendo 201,45 ​​ µg/0,5mL por animal e solução de soro fisológico em sua formulação.

 Cada uma das amostras de cada ensaio (amostra teste + controle positivo) foram realizados em duplicidade, mantendo as mesmas condições de volume, concentração e dose, de modo que fossem realizados dois grupos – o grupo controle referente ao ensaio oficial e o grupo experimental, com as diluições submetidas ao processo de inativação térmica. ​​ 

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2.4 ​​ ​​ Ensaio de Determinação da Dose Letal Média do Veneno Botrópico de Referência (Brabot/005)

 Este ensaio foi realizado 3 vezes e que para cada ensaio foram utilizados volumes variáveis de ​​ de veneno Brabot/005 , em ​​ diluições contendo 62,2; 51,8; 43,2; 36 e 30 µg/0,5mL por animal e solução fisiológica (0,85%) como veículo e ajustada para manter a dose, e grupos de 10 animais.

 Foram realizados ensaios em duplicidade, sendo um para avaliar a DL50 do veneno Brabot/005 e a outra para avaliar a inativação da toxicidade do veneno, mantendo-se as mesmas condições de volume, concentração e dose em ambas as preparações.

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2.5 Ensaio de Avaliação da Inatividade da Toxicidade do veneno botrópico de referência Brabot/005 concentrado a 1mg/mL

 Foi realizados 2 ensaios em paralelos, ambos preparados em uma diluição contendo 1mg/mL (500 µg/0,5mL por animal) de veneno botrópico (BraBot/005) para grupos de 10 animais, repetidos 3 vezes. Um dos ensaios a reconstituição do Brabot/005 liofilizado em solução fisiológica foi realizado para que fosse utlizada nos ensaios do laboatório e controle de qualidade e o residuo sólido, ou seja o veneno liofilizado foi destinado a autoclavação e recostituido posteriormente nas mesmas condições anteriores.

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3. Desenvolvimento e discussão

3.1 Avaliação da inatividade da toxicidade do BraBot/005 frente ao Ensaio de determinação da potência do soro Antibotrópico

 A avaliação da eficácia da inativação térmica do veneno BraBot/005, utilizando resíduos do ensaio de determinação da potência do soro antibotrópico, demonstrou resultados promissores. Nos grupos controle (Grupos I - Controle), compostos por amostras de soro antibotrópico de diferentes lotes (A, B e C), cujas amostras foram aprovadas apresentando o valor da DE50 dentro dos valores previstos na legislação, assim como o controle positivo deste ensaio, 5DL50, apresentaram acima de 80% de óbitos, corroborando com a eficácia do soro antibotrópico e a toxicidade do veneno. No entanto, nos grupos experimentais (Grupo II – Experimental), onde o veneno foi submetido à inativação térmica antes de ser inoculado nos animais, não foram observados óbitos, indicando a completa perda da toxicidade do veneno (tabela 1, 2 e 3).

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3.2 Avaliação da inatividade da toxicidade do brabot/005 frente ao ensaio de determinação da Dose Letal Média (DL50) do veneno BraBot/005

 A fim de determinar a dose letal média (DL50) do veneno botrópico de referência (BraBot/005), foram realizados três ensaios independentes ao longo de um ano, os quais serviram como grupo controle. Paralelamente, foram conduzidos ensaios com o grupo experimental para avaliar a eficácia do tratamento de inativação. Nos ensaios controle, a potência do veneno foi avaliada pela mortalidade dos animais em cada diluição e os resultados foram plotados em gráfico de controle. A DL50 média obtida nos três ensaios foi de aproximadamente 43,9 µg/0,5 mL. Por outro lado, nos ensaios experimentais, não foram observados óbitos nem alterações clínicas ou comportamentais nos animais, indicando a completa perda da toxicidade do veneno após o tratamento (Tabela 4, 5e 6)

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3.3 Ensaio de avaliação da inatividade da toxicidade do veneno botrópico de referência Brabot/005 concentrado a 1mg/mL

 A solução de BraBot/005 (1 mg/mL), obtida pela reconstituição do veneno botrópico liofilizado e administrada por via intraperitoneal aos dez animais do grupo controle, em três ensaios independentes, causou a morte de todos os animais nas primeiras quatro horas após a inoculação. Entretanto, nos ensaios do grupo experimental, onde as soluções de BraBot/005, foram submetidas ao tratamento térmico e posteriormente, em temperatura ambiente, foram administradas aos animais, não foram observados óbitos, nem alterações clínicas ou comportamentais, indicando a completa inativação da toxicidade do veneno após o processo de autoclavagem.

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4. Considerações finais

​​  Os experimentos realizados demonstraram que o veneno botrópico, presente em todas as amostras utilizadas nos ensaios de determinação da potência do soro antibotrópico, na determinação da DL50 do BraBot/005 e nos demais resíduos gerados, foi completamente inativado após submissão ao processo de autoclavagem a 121°C por 60 minutos. A ausência de óbitos nos animais após a inoculação das amostras tratadas atesta a perda da toxicidade do veneno.

 Considerando a natureza proteica do veneno botrópico, a autoclavagem, um método amplamente utilizado para desnaturação de proteínas, foi escolhido como método de tratamento dos resíduos. Conforme as diretrizes do Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA), os resíduos de natureza biológica requerem tratamento adequado antes do descarte [8]. Os resultados obtidos corroboram a eficácia da autoclavagem na inativação do veneno, permitindo o descarte seguro dos resíduos.

• Embora os resultados obtidos neste estudo sejam promissores, recomenda-se a manutenção das práticas de biossegurança, uma vez que estudos adicionais são necessários para avaliar a eficácia da autoclavagem em diferentes condições e para investigar outras possíveis vias de exposição ao veneno.

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5.  Indicação de trabalhos futuros

 Os dados obtidos neste estudo indicam a necessidade de realizar pesquisas adicionais para compreender melhor os mecanismos de exposição ao veneno em diferentes condições e elaborar uma ficha de segurança química completa e detalhada. Além disso, os resultados reforçam a importância de adotar e manter rigorosamente as recomendações de biossegurança, visando garantir a proteção da saúde dos pesquisadores e a preservação do meio ambiente.

6. Declaração de direitos

 Os autores declaram ser detentores dos direitos autorais da presente obra, que o artigo não foi publicado anteriormente e que não está sendo considerado por outra Revista/Journal. Declaram que as imagens e textos publicados são de responsabilidade dos autores, e não possuem direitos autorais reservados à terceiros. Textos e/ou imagens de terceiros são devidamente citados ou devidamente autorizados com concessão de direitos para publicação quando necessário. Declaram respeitar os direitos de terceiros e de Instituições públicas e privadas. Declaram não cometer plágio ou auto plágio e não ter considerado/gerado conteúdos falsos e que a obra é original e de responsabilidade dos autores.

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7. Referências

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• World Health Organization (WHO). Rabies and envenomings: a neglected public health issue. World Health Organization, 2007. [acesso em: 24 de agosto, 2016]; Disponível em: http://www.who.int/bloodproducts/animal_sera/Rabies.pdf

• World Health Organization (WHO). Guidelines for the production, control and regulation of snake antivenom immunoglobulins. 2010. ​​ [acesso em: 30 de agosto, 2016]; Disponível em: http://www.who.int/bloodproducts/snake_antivenoms/SnakeAntivenomGuideline.pdf

• CALVETE, J. J., et al. Venoms, venomics, antivenomics. FEBS letters, v. 583, n. 11, p. 1736-1743, 2009.

• Datasus Tecnologia de Informação a Serviço do SUS. Ministério da Saúde [homepage na internet]. Acidente por animais peçonhentos - notificações registradas no sistema de informação de agravos de notificação - Brasil. [acesso em: 09 de outubro, 2024]; Disponível em: http://tabnet.datasus.gov.br/cgi/tabcgi.exe?sinannet/cnv/animaisbr.def

• Araújo HP, Lucas EPR, Moura WC, Fátima-Barbosa C, Rodrigues RJ, Morais JF, Almada JZ, Guimarães BC, Almeida AECC, Boller MAA. Interlaboratory study for the establishment of Brazilian Bothrops Reference Venom and Antivenom for potency evaluation of Bothrops antivenom. 2017; Biologicals, v. 49, p. 1-5. PubMed; PMID: 28818424.

• Lima, F. H. D. M., de Souza, G. F., Boller, M. A. A., DE SOUZA, I. V., Ribeiro, M. D. J. B., & da Nóbrega, A. W. (2024). Estudo da toxicidade aguda oral e dérmica do veneno Botrópico de referência nacional. Revista Sociedade Científica, 7(1), 3180-3193.

• Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA). Resolução CONAMA nº 358, de 29 de abril de 2005. Dispõe sobre o tratamento e a disposição final dos resíduos dos serviços de saúde e dá outras providências. Diário Oficial da União, Brasília, DF, 4 maio 2005. Seção 1, p. 63-65.