ISSN: 2595-8402
DOI: 10.61411/rsc88448
Publicado em 16 de dezembro de 2023
REVISTA SOCIEDADE CIENTÍFICA, VOLUME 6, NÚMERO 1, ANO 2023
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE LARVICIDA E ADULTICIDA DE DERIVADOS SEMISSINTÉTICOS ALFA-METILESTIRENO PARA O CONTROLE DO MOSQUITO Aedes aegypti (DIPTERA: CULICIDAE) EM CONDIÇÕES DE LABORATÓRIO
KAMILA LIMA DO NASCIMENTO1; ANA CRISTINA DA SILVA PINTO2; DIANA VIEIRA SALES3; ROSEMARY APARECIDA ROQUE4; EUNICE DA SILVA MEDEIROS DO VALE5
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1;2;3;4;5Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia - INPA.Laboratório de Malária e Dengue
RESUMO
O Aedes aegypti é o principal vetor da dengue, febre amarela, Zika e febre chikungunya, desempenhando papel importante em surtos de doenças há mais de um século. O controle químico permanece como o método mais utilizado na prevenção de doenças transmitidas por mosquitos. Porém, há relatos nas literaturas sobre a resistência em populações pelo uso contínuo de inseticidas químicos. Nesse sentido os produtos de origem vegetal, como extratos vegetais, óleos essenciais e derivados de plantas, surgem como uma alternativa promissora. No presente trabalho foi estudado a oleorresina da espécie Protium rubrum, do qual foi isolado o monoterpeno 1-isopropenyl-2,5-dimethoxy-4-methylbenzene (IDMB) e a partir dele foram preparados os derivados semissintéticos DBr, DOBu e DPip. Todas as substâncias foram avaliadas quanto ao seu potencial larvicida e adulticida em A. aegypti. Foi preparada uma solução-mãe de cada substância, solubilizadas em dimetilsulfóxido (DMSO), e a partir destas 50% em sua concentração intermediária, além de apresentar menor concentração letal de CL50 28,05 µg/mL, em comparação às demais substâncias. No bioensaio adulticida observou-se que IDMB causou 50% de mortalidade das fêmeas na concentração de 500 µg/mL, e apresentou menor valor de CL50 28,05 µg/mL, que foram avaliadas para o bioensaio larvicida nas concentrações: 100, 50, 25 e 12,5 e 6,25 µg/mL, e no teste adulticida: 1000, 500, 250 e 125 µg/mL. O resultado do bioensaio larvicida demonstrou que a substância natural IDMB apresentou maior potencial causando mortalidade das larvas comparado aos seus derivados. Este é o primeiro trabalho a demonstrar o efeito larvicida e adulticida da substância majoritária do óleo essencial da espécie P. rubrum em A. aegypti.
Palavras-chave: Burseraceae; Protium rubrum; Monoterpenos; Atividade Inseticida.
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ABSTRACT
Aedes aegypti is the main vector of dengue, yellow fever, Zika and chikungunya fever, playing an important role in disease outbreaks for more than a century. Chemical control remains the most used method for preventing diseases transmitted by mosquitoes. However, there are reports in the literature about resistance in populations due to the continuous use of chemical insecticides. In this sense, products of plant origin, such as plant extracts, essential oils and plant derivatives, emerge as a promising alternative. In the present work, the oleoresin of the species Protium rubrum was studied, from which the monoterpene 1-isopropenyl-2,5-dimethoxy-4-methylbenzene (IDMB) was isolated and from it the semi-synthetic derivatives DBr, DOBu and DPip were prepared. All substances were evaluated for their larvicidal and adulticidal potential on A. aegypti. A stock solution of each substance was prepared, solubilized in dimethyl sulfoxide (DMSO), and from these 50% in its intermediate concentration, in addition to presenting a lower lethal concentration of LC50 28.05 µg/mL, compared to the other substances. In the adulticidal bioassay, it was observed that IDMB caused 50% mortality in females at a concentration of 500 µg/mL, and presented a lower LC50 value of 28.05 µg/mL, which were evaluated for the larvicidal bioassay at concentrations: 100, 50, 25 and 12.5 and 6.25 µg/mL, and in the adulticide test: 1000, 500, 250 and 125 µg/mL. The result of the larvicidal bioassay demonstrated that the natural substance IDMB had greater potential to cause larvae mortality compared to its derivatives. This is the first work to demonstrate the larvicidal and adulticidal effect of the majority substance of the essential oil of the species P. rubrum on A. aegypti.
KEYWORDS: Burseraceae; Protium rubrum; Monoterpenes; Insecticide Activity.
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1 INTRODUÇÃO
O mosquito A. aegypti é originário da África e está presente em quase todos os continentes, menos na Antártida. É o principal vetor na transmissão da dengue, febre amarela, Zika e febre chikungunya desempenhando papel importante em surtos de doenças há mais de um século [1]. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), a dengue é o arbovírus com o maior número de casos na região das Américas, ocorrendo epidemias a cada três a cinco anos. No ano 2022 a região alcançou a marca de 2.811.433 casos de dengue, sendo esse o terceiro ano com o maior número de casos na série histórica, ficando atrás apenas dos anos 2016 e 2019, quando houve maior número de casos notificados [1].
De acordo com dados epidemiológicos do Ministério da Saúde - MS [1], até o mês de setembro de 2023, o Brasil registrou cerca de 1.530.940 casos prováveis e 946 óbitos ocasionados pela dengue, ocorrendo um aumento quanto a taxa de adoecimento e mortes por esta arbovirose, quando comparado ao ano de 2022 (1.172.882 e 585 mortes). Neste mesmo período (2023) ocorreram 5.440 casos de dengue registrados no estado do Amazonas [1]. Os dados demonstram o aumento do número de casos de dengue no Amazonas em comparação ao ano de 2022 com 2.805 casos [1]. Portanto, medidas preventivas e de combate ao A. aegypti não devem ser negligenciadas, haja visto que a dengue é uma doença de grande importância para a saúde pública.
O controle vetorial permanece como o método mais utilizado na prevenção da transmissão de doenças transmitidas por mosquitos. Entre os métodos de controle destaca-se o uso de com o uso de inseticidas químicos, como os piretróides, carbamatos e os organofosforados, essa é uma das abordagens mais utilizada para o controle de populações de mosquitos, pois diminui o número de casos das doenças transmitidas por estes [2, 3]. Contudo, há relatos nas literaturas sobre a resistência em populações de mosquitos pelo uso contínuo dos inseticidas químicos, dificultando os esforços em realizar o controle em nível mundial [3]. Além do mais, esses inseticidas apresentam uma elevada toxicidade aos seres humanos e a outros organismos não alvos, como também um elevado potencial contaminante do solo e da água [4]
Em decorrência dos problemas expostos do uso contínuo dos inseticidas sintéticos, vários estudos estão buscando novas alternativas para serem incorporadas no controle de insetos vetores. Nesse sentido os produtos de origem vegetal, como os extratos vegetais, óleos essenciais e derivados botânicos, surgem como uma alternativa promissora, pois apresentam em sua composição, diferentes substâncias que são capazes de agir em todas as fases do desenvolvimento dos insetos [5]. Em vista disto, é crescente o número de estudos voltados na busca de produtos alternativos com baixa toxicidade para o ser humano, animais e meio ambiente, como os inseticidas de origem botânica que possam ser utilizados no controle do A. aegypti [6, 7, 5].
Neste contexto, enfatiza-se a existência de diversas famílias botânicas que apresentam atividade inseticida, entre as quais pode-se citar as famílias Burseraceae, Piperaceae, Myrtaceae, Fabaceae, Asteraceae, Apiaceae, Lamiaceae, entre outras, caracterizadas pela produção de compostos bioativos com ação ovicida, larvicida, adulticida em A. aegypti [8, 9,10, 5]. A família Burseraceae apresenta ampla distribuição na floresta amazônica, a Protium é o principal gênero da família e um dos gêneros mais difundidos na América do Sul sendo muito representativo na flora da região amazônica [11, 12, 13].
A família possui espécies com elevados níveis de monoterpenos em sua oleorresina [14]. A oleorresina do gênero Protium, é muito utilizada em cosméticos [15], na produção de verniz e como produtos medicinais [11]. O extrato hexânico obtido a partir da oleorresina de P. rubrum mostrou atividade citotóxica nas linhagens de células tumorais de cólon (HCT-8), gliobastoma (SF-295) e moderada atividade para melanoma (MDA/MB-435) [16, 17]. Apresentam também toxicidade para diversos grupos de insetos, incluindo a atividade inseticida para o mosquito transmissores de doenças [18, 19, 20, 21, 22, 23]. A ação tóxica da oleorresina em insetos, decorre da presença de substâncias terpênicas, sendo um grupo de compostos químicos originados do metabolismo secundário das plantas, com função de protegê-las contra a herbivoría [24]. Os monoterpenos apresentam ação nociva para insetos, como inibição da acetilcolinesterase (AChE) [25], dessa forma, quando ocore há inibição da acetilcolinesterase (AChE) enzima que promove a hidrólise da acetilcolina, eleva-se a quantidade de AChE nas sinapses, gerando paralisia e consequentemente a morte do inseto [24, 26].
O presente estudo utilizou a espécie Protium rubrum, conhecida popularmente como breu vermelho, encontrada nos estados do Pará, Amazonas, Amapá, Rondônia, Mato Grosso, bem como em países adjacentes como Colômbia, Venezuela e Guianas [17]. A partir da oleorresina da P. rubrum, foi isolado o monoterpeno 1-isopropenyl-2,5-dimethoxy-4-methylbenzene (IDMB) composto majoritário (84%) com o objetivo de avaliar o potencial larvicida e adulticida desta molécula e de seus derivados semissintéticos, visando a investigação de novas substâncias que possam servir como alternativas para o controle do A. aegypti, bem como, biodegradáveis e seguras para a saúde humana [17].
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2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 MATERIAL VEGETAL E EXTRAÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL
A espécie P. rubrum foi coletada na Reserva Florestal Adolpho Ducke (km 26, rodovia AM-010, Manaus, AM). O óleo essencial foi extraído da resina (100g) por sistema de Clevenger, sendo o componente majoritário isolado por cromatografia em camada delgada de sílica gel 60 (70-230 mesh) eluída com mistura de solventes hexanos: acetato de etila (9:1, 8:2, 7:3, 1:1) resultando em um óleo incolor identificado por RMN 1H e 13C e comparados com dados da literatura [17].
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2.2 PREPARAÇÃO DOS DERIVADOS SEMISSINTÉTICOS
A substância natural IDMB (100 mg; 0,52 mmol) foi diluída em diclorometano (DCM, 1 mL, Synth®), e adicionado Br2 (0,5 mL, Vetec®) em DCM (0,5 mL, Synth®), deixando-se sob agitação à temperatura ambiente por 1 h. Após esse tempo a fase orgânica foi lavada com água, em seguida extraída com DCM, seca com Na2CO3 anidro (Moderna®), filtrada e evaporada obtendo-se o derivado bromo. O derivado foi purificado por cromatografia em coluna eluída com hexanos: acetona (9:1) obtendo-se uma substância sólida laranja com 236 mg, 70%, denominada como DBr (Figura 1). O derivado bromo (DBr, 82,4 mg; 0,30 mmol) foi diluído em DCM (1 mL) e piperidina (1 mL, Acros) e deixado em agitação em temperatura ambiente por 24 h. A fase orgânica foi lavada com água, em seguida extraída com DCM, seca com Na2CO3 anidro (Moderna®), filtrada e evaporada obtendo-se a substância sólida amarela com 96,9 mg, 97%, designada como DPip (Figura 1).
A substância natural IDMB (50 mg; 0,26 mmol) foi diluída em 1,0 mL de tetrahidrofurano (THF, Quimesp®), acetato de mercúrio (1,5 eq-g, Dinâmica®) e em 1-butanol (1 mL, Dinâmica®) sob agitação e N2 (0 ºC à temperatura ambiente). Neste processo a reação ficou em agitação por 5 dias em temperatura ambiente. Após esse tempo, o intermediário organomercurado foi reduzido por adição de solução aquosa de NaBH4/KOH (3:1, Labtech®). A solução foi filtrada e extraída com DCM. A fase orgânica foi lavada com água, em seguida com solução saturada de NaCl (Dinâmica®) e seco com Na2CO3 (Dinâmica®), e após remoção do solvente obteve-se derivado éter na forma bruta. O derivado etérico foi purificado por cromatografia em coluna por eluição com Hex:AcOEt (9:1) obtendo-se uma substância sólida amarelo de 118,9 mg, 80%, intitulada como DOBu (Figura 1).
Os derivados semissintéticos foram submetidos à análise de RMN 1H e 13C para identificação das moléculas, avaliadas em ensaios biológicos, bem como alguns dados físico-químicos foram calculados utilizando o programa ACD/Labs v.12.0 Copyright© 1997–2009 Advanced Chemistry Development.
Figura 1. Esquema da síntese dos derivados do IDMB.
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2.3 CRIAÇÃO E MANUTENÇÃO DE Aedes aegypti NO INSETÁRIO
Para realização dos ensaios foi necessário inicialmente a criação de uma colônia de mosquito A. aegypti. Foram utilizados ovos provenientes de desovas da colônia permanente, mantida no insetário do Laboratório de Vetores de Malária e Dengue (LMD) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA). No insetário as condições para criação dos mosquitos foram controladas, temperatura de 27 ºC, umidade relativa em torno 70-80 % e fotoperíodo de 12 horas [27].
As tiras de papel filtro contendo ovos de A. aegypti foram transferidas para recipientes retangulares contendo aproximadamente 100 mL de água e alimento. O alimento utilizado na alimentação foi formulado a partir de ração de felino (Whiskas®) e roedor (TekLab Global 18%®), na proporção de 1:1, previamente trituradas e maceradas resultando em grânulos finos. Conforme ocorriam as eclosões, as larvas eram separadas e transferidas para outras bacias plásticas de acordo com seus estádios larvais. Ressalta-se que diariamente eram realizadas higienização dos recipientes, por meio da troca da água.
Todas as larvas permaneceram nos recipientes plásticos até tornarem-se pupas, e quando atingiam este estágio eram transferidas para copos plásticos com capacidade de 50 mL com cerca de 20 mL de água, sem o fornecimento de ração, em seguida transferidas para a gaiola, para emergência dos mosquitos adultos [28].
Os adultos foram identificados com auxílio de chaves específicas [29], e posteriormente, transferidos para gaiolas, sendo colocados indivíduos machos e fêmeas para reprodução. Os adultos foram alimentados com solução de sacarose açucarada a 10%, contida em erlenmeyer com algodão umedecido e, para as fêmeas, duas vezes por semana foi oferecido repasto sanguíneo com a utilização do hamster (Mesocricetus auratus) devidamente anestesiado (CEUA-048/2023), colocado em cima da gaiola de criação dos mosquitos por aproximadamente 10 minutos.
Posteriormente ao repasto sanguíneo eram introduzidos copos plásticos de 50 mL contendo aproximadamente 20 mL de água forrados internamente com tiras de papel filtro, para servir como substrato para as fêmeas depositarem seus ovos. Após três dias, os copos contendo as tiras com ovos eram retirados das gaiolas e, posteriormente, foram postos para secar.
Após a secagem das tiras contendo os ovos, eram armazenados em envelopes de papel, identificados com o nome da espécie e a data que foram retirados da gaiola. Desta forma, os ovos obtidos nesta colônia-mãe foram utilizados para a criação de fêmeas utilizadas nos bioensaios adulticida, bem como utilizados na obtenção de larvas usadas no teste larvicida.
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3 BIOENSAIO
3.1 ATIVIDADE LARVICIDA
Os bioensaios seguiram o protocolo da Organização Mundial de Saúde [30], e segundo os critérios de Dulmage et al., [31]. Inicialmente, para cada substância, foi preparada uma solução-mãe. Para isto, as amostras IDMB (21,6 mg), DBr (20,5 mg), DOBu (20,7 mg) e DPip (20,8 mg) foram solubilizadas em 600, 603, 609 e 612 µL de solvente dimetilsulfóxido (DMSO, Dinâmica®), respectivamente. Em seguida, foram montados cinco copos plásticos de 180 mL, em triplicata, e para cada copo foi acrescentado: 20 mL de água destilada, 15 larvas de A. aegypti em terceiro estádio, o alimento em diferentes concentrações (100, 50, 25, 12,5 e 6,25 µg/mL).
Foram preparados dois grupos controles: No grupo controle negativo, foram utilizadas as concentrações 100, 50, 25, 12,5 e 6,25 µL de DMSO e no grupo controle positivo foi utilizado o produto biológico espinosade em sua formulação líquida (NatularTM 20EC - 20,65% Spinosad al, Clarke Mosquito Control Products, Inc.), recomendado pelo Ministério da Saúde (MS 2021) nas concentrações 12,5; 6,25; 3,125; 1,56 e 0,78 µg/mL.
As avaliações dos bioensaios, foi por meio da contagem das larvas vivas e mortas, nos intervalos de 24, 48 e 72 h. Os índices de mortalidade observados nos controles negativos serviram como base para verificar a mortalidade natural das larvas que, segundo Dulmage e colaboradores, não deveria ultrapassar 10% [31].
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3.2 ANÁLISE DOS DADOS
Os dados da mortalidade obtidos nos bioensaios de dose foram utilizados para determinação das concentrações letais medianas (CL50 e CL99), submetidos à análise Probit, com p ≤ 0,05 [32], considerando o nível de significância de 95%, utilizando o programa estatístico Polo Plus 1.0 (LeOra Software, CA, EUA) por meio de regressão linear dose-resposta.
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3.3 ATIVIDADE ADULTICIDA
A avaliação do potencial adulticida das substâncias foi realizada no Laboratório de Malária e Dengue - LMD (INPA), sob condições controladas de temperatura 26 ± 2 ºC e umidade de 80% ± 2 ºC. Os bioensaios adulticidas foram realizados por meio do teste de prova biológica de garrafa, seguindo a metodologia descrita por Brogdon e Chan [33].
Na realização do teste foram utilizadas garrafas com capacidade de 250 mL, contendo uma tampa de rosca, previamente lavadas com sabão neutro e água, autoclavadas e secas em estufa a 60 °C, por 40 minutos. Após este procedimento, as garrafas foram identificadas e etiquetadas conforme cada concentração a ser avaliada, e foram testadas quatro concentrações 1000, 500, 250 e 125 µg/mL.
As concentrações foram preparadas a partir de 1 mL de cada solução da amostra, solubilizada em acetona, sendo posteriormente utilizadas para impregnar a parede das garrafas, que foram deixadas deitadas e cobertas com papel toalha, por 24 h para evaporação do solvente.
Cada concentração foi testada em triplicata e, em cada garrafa, foram introduzidas 15 fêmeas dos mosquitos adultos, alimentadas 12 horas antes do teste. Em cada ensaio foram preparados dois grupos de controles: um negativo e um positivo. No grupo controle negativo as três garrafas (em triplicata) foram impregnadas apenas com 1 mL de acetona. O controle positivo foi utilizado o inseticida Cielo-ULV, preconizado para as atividades de controle químico [34], nas concentrações de 31; 7,8; 1,9; 0,95; e 0,47 ng/mL.
As leituras foram realizadas de 15 em 15 minutos até completar 90 minutos, sendo registrado o número de indivíduos mortos e sob o efeito Knockdown (imobilidade de movimentos), em cada concentração.
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4 RESULTADOS
4.1 ISOLAMENTO E PREPARO DE DERIVADOS SEMISSINTÉTICOS
O óleo essencial extraído da oleorresina de P. rubrum rendeu cerca de 200 mg do qual foi isolado 182,2 mg (91%) de alfa-metilestireno (IDMB). Esta substância majoritária foi identificada como sendo a 1-isopropenil-2,5-dimetoxi-4-metilbenzeno (IDMB), por dados de RMN de 1H e 13C, que é um monoterpeno da série p-mentano muito comum em oleorresinas de espécies da família Burseraceae, apresentando hidroxilas e insaturações em diferentes posições da cadeia molecular e podem variar sua concentração de 5 % a 74 % no óleo essencial em espécies de Protium (Rudiger, 2012). O alfa-metilestireno apresentou-se como óleo incolor de fórmula molecular de C12H16O2, composição de C (74,9%), H (8,4%) e O (16,6%), peso molecular de 192,3 g/mol, densidade de 0,96 ± 0,06 g/cm3 e logP de 3,1.
RMN 1H (CDCl3, 500 MHz): δ 1,94 (3H, s, Me), 2,16 (3H, s, MeAr), 3,76 (3H, s, OMe), 3,85 (3H, s, OMe), 4,92 (1H, d, J = 1,3 Hz, =CH), 5,74 (1H, d, J = 1,3 Hz, =CH), 6,62 (1H, d, J = 0,5 Hz), 7,02 (1H, d, J = 0,5 Hz).
RMN 13C (CDCl3, 125 MHz): δ 16,0 (1C, MeAr), 21,9 (1C, Me), 56,0 (2C, OMe), 113,0 (1C, =CH2), 114,6 (1C, CHAr), 115,6 (1C, CHAr), 116,4 (1C), 124,9 (1C), 142,9 (1C), 156,3 (1C), 156,5 (1C).
A substância DBr foi identificada por RMN de 1H e 13C como sendo a 1-(3-bromoprop-1-en-2-il)-2,5-dimetoxi-4-metil-benzeno, apresentou-se como sólido laranja de fórmula molecular de C12H15BrO2, composição de C (53,1%), H (5,6%), Br (29,5%) e O (11,8%), peso molecular de 271,1 g/mol, densidade de 1,27 ± 0,06 g/cm3 e logP de 3,4.
RMN 1H (CDCl3, 500 MHz): δ 1,41 (3H, s, Me), 2,17 (3H, s, MeAr), 3,75 (2H, s, CH2Br), 3,77 (3H, s, OMe), 3,80 (3H, s, OMe), 6.33 (1H, d, J = 0.5 Hz, CHAr), 6.59 (1H, d, J = 0.5 Hz, CHAr).
RMN 13C (CDCl3, 125 MHz): δ 16.0 (1C, MeAr), 29.8 (1C, Me), 37.8 (1C, CH2-Br), 56.0 (2C, 2OMe), 67.6 (1C, C), 110.6 (1C, CHAr), 115.6 (1C, CHAr), 124.9 (1C, C), 128.0 (1C, C), 156.3 (1C, C), 156.5 (1C, C).
A substância DPip foi identificada por RMN de 1H e 13C como sendo a 1-[2-(2,5-dimetoxi-4-metilfenil)-prop-2-en-1-il]-piperidina, apresentou-se como sólido amarelo de fórmula molecular de C17H25NO2, composição de C (74,1%) H (9,1%) N (5,1%) O (11,6%), peso molecular de 275,4 g/mol, densidade de 1,00 ± 0,06 g/cm3 e logP de 3,3.
RMN 1H (CDCl3, 500 MHz): δ 1,39 (1H, s, Me), 1,47 (dtt, J = 10,9; 6,7; 2,8 Hz, CH2), 1,73 (4H, m, CH2), 2,17 (3H, s, Me-Ar), 2.46 (2H, dt, J = 14.0, 2.8 Hz, -CH2N), 2.63 (2H, dt, J = 14.0, 6.5 Hz, -CH2N), 2,79 (2H, s, CH2), 3.77 (3H, s, OMe), 3.81 (3H, s, OMe), 6.32 (1H, d, J = 0.5 Hz, -CHAr), 6.59 (1H, d, J = 0.5 Hz, -CHAr).
RMN 13C (CDCl3, 125 MHz): δ 16.0 (1C, Me-Ar), 24.3 (1C, -CH2), 25.6 (2C, -CH2-), 29.8 (1C, -Me), 49.1 (1C, CH2-N), 54.2 (2C, -CH2-N), 56.0 (2C, -OMe), 67.6 (1C, -CBr), 110.6 (1C, -CH), 115.6 (1C, -CHAr), 124.9 (1C, C), 128.0 (1C, C), 156.3 (1C, C), 156.5 (1C, C).
A substância DOBu foi identificada por RMN de 1H e 13C como a 1-(1-butoxipropan-2-il)-2,5-dimetoxi-4-metil-benzeno, apresentou-se como sólido amarelo de fórmula molecular de C16H26O3, composição de C (72,1%) H (9,8%) O (18,0%), peso molecular de 266,4 g/mol e densidade de 0,96 ± 0,06 g/cm3.
RMN 1H (CDCl3, 500 MHz): δ 0,88 (3H, t, J= 7,1 Hz, Me), 1,24-1,47 (5H, 1,30 (d, J= 6,7 Hz, Me), 1,40 (2H, tq, J= 7,4 e 7,1 Hz, -CH), 1,63-1,76 (2H, 1,70 (tt, J= 7,4 e 6,9 Hz, -CH), 2,16 (3H, s, -CH3), 3,15 (1H, qt, J= 6,7 e 6,0 Hz, -CH), 3,31-3,43 (2H, 3,37 (t, J= 6,9 Hz, -CH2), 3,57-3,68 (2H, 3,63 (d, J= 6,0 Hz, -CH2), 3,75 (3H, s, OMe), 3,77 (3H, s, OMe), 6,52-6,67 (2H, 6,57 (d, J= 0,5 Hz, CH), 6,62 (d, J= 0,5 Hz, CH).
RMN 13C (CDCl3, 125 MHz): δ 14,0 (1C, Me), 16,0 (1C, -MeAr), 18,0 (1C, Me), 19,1 (1C, -CH2), 31,1 (1C, -CH2), 42,4 (1C, -CH), 56,0 (2C, 2OMe), 69,8 (1C, -CH2), 71,2 (1C, -CH2), 114,8 (1C, -CHAr), 115,6 (1C, -CHAr), 124,1 (1C, -CHAr), 124,9 (1C, -CHAr), 156,3 (1C, -CH), 156,5 (1C, -CH).
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4.2 ATIVIDADE LARVICIDA
A partir dos dados obtidos é possível observar que a substância natural (IDMB) seus derivados DBr e DOBu mostraram atividade larvicida para larvas de A. aegypti, constatando que DBr foi mais tóxico para as larvas em 24 horas com CL50 de 28,05 µg/mL seguido do DOBu com CL50 de 35,92 µg/mL, com intervalo de confiança de 95% (IC95%, Tabela 1). O derivado DPip não apresentou atividade larvicida em nenhuma das concentrações testadas.
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Tabela 1 - Valores de CL50 (µg/mL) do óleo essencial da Protium rubrum e seus derivados semissintéticos em larvas de Aedes aegypti nos intervalos de 24, 48 e 72 horas.
Substâncias | 24h (IC 95%) µg/mL | χ2 | Slope ±SE | 48h (IC 95%) µg/mL | χ2 | Slope ±SE | 72h (IC 95%) µg/mL | χ2 | Slope ±SE | GL |
IDMB | 78,35 (70,77 - 86,26) | NC | 8,72 (1,30) | NC | 6,10 | 0,08 (0,43) | NC | 10,91 | 0,24 (0,49) | 3 |
IDMBBr | 28,05 (23,22-33,87) | 16,93 | 2,67 (0,22) | 0,06 (0,00 - 0,6) | 2,61 | 0,71 (0,34) | 0,08 (0,00 - 1,4) | 7,75 | 0,18 (0,44) | 3 |
IDMBPip | NA | - | - | NA | - | - | NA | - | - | 3 |
IDMBOBu | 35,92 (32,41 - 39,80) | 0,018 | 7,78 (1,10) | 0,264 (0,16 - 0,47) | 75,14 | 2,32 (0,21) | NC | 44,80 | 0,36 (0,31) | 3 |
Espinosade mg/mL | 0,12 (0,11 – 0,13) | 9,14 | 2,87 (0,10) | 0,08 (0,08 – 0,09) | 3,49 | 3,29 (0,15) | NC | NC | NC | 3 |
χ2 – Qui-quadrado; SE-Erro padrão; IC- Intervalo de confiança; GL-Grau de liberdade; *NC-não calculado; *NA=não ativo
O biolarvicida Espinosade foi usado como controle positivo e apresentou CL50 de 0,12 mg/mL e CL50 de 0,08 mg/mL nas leituras de 24 e 48 horas. O controle negativo DMSO/H2O (1%) mostraram mortalidade ≤ 5%. Na figura 2 é possível observar e comparar o percentual de mortalidade, tanto da substância natural quanto seus derivados DOBu, DPip e DBr, observando-se que os derivados DOBu e DBr causaram mortalidade acima de 80% das larvas na concentração de 100 e 50 µg/mL. Contudo, observou-se que o derivado DBr apresentou mortalidade acima de 50% nas concentrações de 25 a 100 µg/mL.
.Figura 2- Índice comparativo do potencial larvicida do IDMB e seus derivados semissintéticos
4.3 ATIVIDADE ADULTICIDA
No teste adulticida constatou-se que a substância natural IDME apresentou mortalidade variando de 100%, na concentração de 1000 μg/mL apresentando CL50 de 120,98 µg/mL com intervalo de confiança de IC95% (tabela 3), na concentração de 500 μg/mL, apresentou mortalidade acima de 50%, em 30 minutos de avaliação, diferente dos derivados DBr, DPip e DOBu que não mostraram atividade adulticida, pois a mortalidade ficou abaixo de 30%. Quanto ao controle positivo, observou-se mortalidade de 100% com CL50 de 0,10 ± 1,0 ng/mL (tabela 2) No controle negativo não houve mortalidade de mosquitos.
Tabela 2 – Valores de CL50 (µg/mL) do óleo da Protium rubrum e seus derivados em adultos de A. aegypti nos intervalos de observação de 90 minutos.
Substância | 24h (IC 95%) µg/mL CL50 | χ2 | Slope ±SE | GL |
IDMB | 120,98 (89,79 – 143,64) | 0,39 | 4,15 (0,86) | 2 |
DBr | 431,88 (361,08 - 524,18) | 1,08 | 2,75 (0,37) | 2 |
DPip | >500 | 1,81 | 3,28 (0,43) | 2 |
DOBu | >500 | 11,06 | 3,44 (0,53) | 2 |
Cielo ng/mL | 0,10 (0,04 - 0,12) | 30,74 | 7,70 (0,83) | 4 |
*IC - Intervalo de confiança; *χ2 – Qui-quadrado; *SE-Erro padrão; GL- *Grau de liberdade.
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5 DISCUSSÃO
Os dados de espectro de RMN de 1H do alfa-metilestireno apresentaram sinais de simpletos em δ 3,76 e 3,85 ppm referentes aos grupos metoxilas presentes na moléculas, sinal em δ 2,16 ppm referente ao grupo metila ligada ao anel aromático, sinal em δ 1,94 ppm referente ao grupo metila ligada ao carbono da dupla ligação, sinais dupletos em δ 4,92 e 5,74 ppm referentes aos hidrogênios metilênico da dupla ligação e sinais dupletos em δ 6,62 e 7,02 ppm referentes aos carbonos metínicos do anel aromático. O espectro de RMN de 13C apresentou 10 sinais simpletos referentes aos carbonos presentes na molécula, sendo o sinal em δ 56,0 referentes aos dois grupos metoxilas. Para os derivados semissintéticos do IDMB os espectros de RMN de 1H para o DBr apresentou sinal simpleto em δ 3,75 ppm referente ao carbono metilênico ligado ao átomo de Br e sinal no espectro de RMN 13C em δ 37,8 e 67,6 ppm onde adição dos átomos de Br. Para o derivado DPip foi observado a adição do grupo piperidina através dos deslocamentos químicos apresentados nos espectros mostrando sinais em δ 2,46, 2,63, 1,73, 1,47 ppm referente ao anel piperidina. Para o derivado DOBu foi observado no espectro de RMN 1H onde apresentou sinais em δ 3,37, 1,70, 1,4 e 0,88 ppm referentes aos sinais para adição do grupo éter O-butil à dupla ligação.
Até o momento não tinha sido relatada atividade larvicida e adulticida da espécie P. rubrum para o vetor da dengue, o mosquito A. aegypti. Neste sentido foi realizada buscas de estudos direcionados para a classe de monoterpenos, da série p-mentano, com potencial inseticida para o mosquito. Os principais monoterpenos encontrados nos óleos essenciais resinosos são derivados dos esqueletos p-mentano - monocíclico e pinano - bicíclico [16]. Os resultados do presente estudo estão de acordo aos observados por Nascimento [16], que analisou a atividade larvicida do monoterpeno 2-iso-propil-5-metilfenol, observando mortalidade de 100% das larvas de A. aegypti em 24 h na concentração de 0,1 mg/mL. Lopes et al., [35] observou que o óleo essencial de Peumus boldus, rico em monoterpenos 1,8-cineol e ascaridol, apresentou valor de CL50 de 40,53 µg/mL para A. aegypti confirmando atividade larvicida. Souza et al., [36] ao analisar o óleo essencial de Citrus aurantifolia, com altos níveis monoterpenos como limoneno, p-cimeno e γ-terpineno também constatou ação larvicida para A. aegypti apresentando valor de CL50 igual à 18,68 μg/mL. Faustino et al., [23], observou atividade larvicida quando avaliou a nanoemulsão da oleorresina da espécie Protium heptaphyllum em A. aegypti, este mostrou-se muito ativo com CL50 2,91 µg/mL em 24 h, valor menor do que o apresentado, confirmando o potencial para controlar as larvas do mosquito.
Ao comparar os resultados obtidos nos bioensaios com as larvas e adultos, observou-se que o derivado DPip não mostrou atividade larvicida, porém foi ativo para os adultos de A. aegypti. Segundo Spletozer et al., [5], esse resultado da ação do DPip nos ensaios adulticidas pode estar relacionado no modo de absorção por meio do contato com o exoesqueleto de quitina do mosquito, o que pode ser tóxico e consequentemente, causar a morte. Com relação ao valor de CL50 Botelho et al., [37], avaliaram o óleo essencial de Ocimum basilicum var. minimum (L.) rico em monoterpenos como limoneno e 1,8-cineol em adultos de A. aegypti, apresentando valor de CL50 de 69,91 µg/mL. Esses resultados corroboram com os encontrados neste estudo, porém o óleo de IDMB se mostrou mais ativo, com valor de CL50 igual à 59,45 µg/mL em 24 h. Esta atividade pode ser atribuída principalmente aos compostos majoritários presentes no IDMB, ou mesmo na ação sinérgica dos constituintes químicos do óleo de IDMB, pois é um fator importante para atividade larvicida dos óleos essenciais [38]. Nas espécies Guatteria friesina e Guateria blephorophyla os constituintes do óleo essencial, β-eudesmol e óxido cariofileno não apresentaram atividade larvicida quando foram testados isoladamente, porém, quando testado o óleo essencial com todos os seus compostos apresentou atividade [39]. Em estudos realizados por Baker et al., [40] foi identificado o potencial inseticida tópico de três monoterpenóides, mentona, fenchona e carvona, incluindo suas capacidades de sinergizar inseticidas estabelecidos utilizados para adultos de A. aegypti. Neste contexto, observa-se, na literatura, que as moléculas que fazem parte da classe monoterpênicas apresentam ação inseticida comprovada, corroborando com os resultados dos monoterpenos utilizados no presente estudo, que apresentaram ação larvicida e adulticida para o A. aegypti.
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6 CONCLUSÃO
Os resultados do presente trabalho até o momento, é o primeiro a demonstrar o efeito larvicida e adulticida da P. rubrum em A. aegypti. Foi evidenciado que a substância natural (IDMB) apresentou ação larvicida na maior concentração e seus derivados DBr e DOBu foram mais ativos, demonstrando que estes derivados se mostram promissores quando comparados à substância natural. Quanto à ação em adultos, verificou-se que a substância natural IDMB demonstrou melhor eficiência na mortalidade dos mosquitos adultos de A. aegypti, comparadas aos derivados semissintéticos avaliados.
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